昂沙爾·畢哈孜，霍新慧，丁 霞

（新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院針灸基礎(chǔ)教研室，烏魯木齊 830011）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）為常見的以滑膜炎、軟骨及骨損害和關(guān)節(jié)周圍脫鈣為特點(diǎn)的疾病[1]，發(fā)病率和致殘率較高[2]，以疼痛、皮下結(jié)節(jié)、關(guān)節(jié)畸形等為表現(xiàn)，可引起多系統(tǒng)組織損壞，甚至影響患者日常生活[3]。病理以滑膜細(xì)胞增生為主[4]。西藥診療RA 不良反應(yīng)多，易產(chǎn)生耐藥性[5]；中草藥具有很強(qiáng)抗炎、抗氧化活性,可減輕組織損傷[6];灸法、針刺等輔助療法也在RA 治療中有一定的作用[7]。本課題組前期研究明確，刺山柑和中醫(yī)外治法溫和灸對(duì)佐劑性RA 大鼠有鎮(zhèn)痛抗炎作用[8]。本研究進(jìn)一步觀察刺山柑風(fēng)濕止痛貼聯(lián)合溫和灸對(duì)滑膜組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和可溶性細(xì)胞間黏附分子-1（solub leinter cellular adhesion molecule slCAM-1）表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無特定病原體(SPF) 級(jí)Wistar 大鼠60 只，雌雄參半，體重為160～200 g（動(dòng)物供應(yīng)中心-新疆醫(yī)科大學(xué)）。在濕度55%～60%，20～24℃條件下飼養(yǎng)，明暗交替24 h，任意進(jìn)食水。

1.2 藥品與試劑弗氏完全佐劑（Sigma 公司），艾條（江蘇康美制藥有限公司），懸灸架（蘄春上工記艾灸器具有限公司），刺山柑果風(fēng)濕止痛貼(20161022) 于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源部供應(yīng)。傷濕止痛膏(20170100）由黃石市力康藥業(yè)公司購買。大鼠sl-CAM-1 及VEGF 的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、VEGF 抗體購自Elabsciece 公司，內(nèi)參GAPPH(GR3249122-1)由英國(guó)Abcam公司購置。

1.3 設(shè)備購自成都泰盟有限公司(泰盟RB-200)的熱板儀；瑞士Tecan 公司提供的全自動(dòng)酶標(biāo)儀；美國(guó)BIO-RAD Serial 提供的用型電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)印槽、經(jīng)濟(jì)型線性搖床及美國(guó)Proteinsimple(FE0723)提供的超靈敏全自動(dòng)多色熒光成像分析系統(tǒng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 制備模型 60 只大鼠喂養(yǎng)3 d（稱重、標(biāo)號(hào)）后，用隨機(jī)數(shù)字表法，取10只為空白組，其余大鼠進(jìn)行佐劑型RA 大鼠造模，完全弗氏佐劑（0.1 mL 每只）足趾皮內(nèi)注射，72 h后進(jìn)行測(cè)評(píng)。依據(jù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分評(píng)定[9]：0 分,無紅腫;1 分,足趾輕微紅腫;2 分,足跖與趾關(guān)節(jié)腫脹;3 分，足爪腫脹在踝關(guān)節(jié)之下;4 分,全部足爪腫脹5 分。每只大鼠的AI即四肢評(píng)分?jǐn)?shù)相加，大于6分造模成功。

1.4.2 分組干預(yù)及穴位選取 隨機(jī)分佐劑型RA 大鼠為模型組、對(duì)照組、刺山柑組、灸療組、綜合組，每組10 只。對(duì)照組予以傷濕止痛膏，刺山柑組予以刺山柑風(fēng)濕止痛貼，模型組予以空白凝膠膏劑，均左后足趾經(jīng)皮給藥。灸療組選取兩側(cè)腎俞、足三里穴予以溫和灸，左右交替進(jìn)行[8]。操作方法：以懸灸支架固定艾條，引燃艾條距離腧穴皮膚2 cm 處施灸，每2 min 輕彈艾灰，不吹火，灸至肌膚潮紅，溫?zé)?，可以忍受為度。兩穴同時(shí)進(jìn)行，每日1 次。以上治療行3 個(gè)療程，6 d 為1 個(gè)療程，各療程之間停休1 d。綜合組予以刺山柑風(fēng)濕止痛貼與溫和灸綜合治療。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 一般狀態(tài) 每天對(duì)大鼠的體質(zhì)量、精神及活動(dòng)情況、飲食攝水量、大小便等一般情況進(jìn)行觀察并做好相應(yīng)記錄。

1.5.2 足爪容積測(cè)定與AI指數(shù) 足爪容積測(cè)定：在注滿水的玻璃刻度管中垂直插入大鼠足部至踝關(guān)節(jié)上方約l cm 后取出，加水至之前水面高度，標(biāo)記剩下水量，兩者之差為足爪容積。測(cè)2次取平均值為減少誤差。AI指數(shù)評(píng)分方法同前。

1.5.3 血清VEGF、HIF-1a、slCAM-1 水平的檢測(cè) 治療后的大鼠予以腹主動(dòng)脈采血，常溫放1 h 將血清分離，-20℃保存。大鼠血清VEGF、HIF-1a、slCAM-1水平用ELISA試劑盒檢測(cè)，具體按說明書規(guī)范操作。

1.5.4 滑膜組織VEGF蛋白表達(dá)測(cè)定 處死大鼠并用手術(shù)刀將左后足跖皮膚劃開至大腿部，使踝關(guān)節(jié)周圍的軟組織完全剝離，將其放入4%多聚甲醛固定液中待用。病理切片滑膜組織，脫蠟至水；大鼠滑膜組織VEGF 的表達(dá)按照蛋白印跡(western blot)法檢測(cè)，GAPDH 為內(nèi)參。取大鼠滑膜組織用冰研磨，然后離心分離取上清，使用BCA 蛋白質(zhì)試劑盒測(cè)定蛋白量；予加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，大鼠一抗VEGF(1∶500)4℃冰箱過夜，經(jīng)過洗膜3 次后，ECL 顯色，曝光及沖洗；采用Gel Doc XR 軟件，算出VEGF 蛋白與GAPPH 吸光度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素方差分析用于各組間均數(shù)比較。組間均數(shù)采用多重比較，方差齊時(shí)使用LSD 法，方差不齊時(shí)使用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠一般情況的影響造模后的佐劑型RA大鼠每日無精打采、食欲及體重下降，足部出現(xiàn)紅腫，左后肢足跖部較嚴(yán)重，伴有部分四肢輕微紅腫。治療后大鼠精神和活動(dòng)度等均有所改進(jìn)，食量和體重均有增加。

2.2 對(duì)佐劑大鼠足爪容積和AI指數(shù)評(píng)分的影響與空白組相比，造模后大鼠足爪容積和AI 指數(shù)評(píng)分顯著上調(diào)(P＜0.01),相比模型組，治療組足爪容積和AI指數(shù)評(píng)分均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 每組大鼠AI指數(shù)評(píng)分和足爪容積比較（，n=10）

表1 每組大鼠AI指數(shù)評(píng)分和足爪容積比較（，n=10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.3 對(duì)大鼠血清VEGF 水平的影響與空白組相比，模型組大鼠血清VEGF 水平均上調(diào)(P＜0.01)，對(duì)照組也顯著上調(diào)(P＜0.01)；與模型組比較，灸療組和綜合組顯著下降(P＜0.05)，刺山柑組的各項(xiàng)指標(biāo)均下降(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，刺山柑組、灸療組與綜合組VEGF水平均下降(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 各組血清VEGF比較（pg/mL，）

表2 各組血清VEGF比較（pg/mL，）

注：與空白組比較，＊P＜0.01；各治療組與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.4 對(duì)大鼠血清HIF-1a 水平的影響與空白組比較，模型組大鼠血清HIF-1a水平均升高(P＜0.01)，對(duì)照組的HIF-1a 水平也明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，灸療組、刺山柑組、綜合組的HIF-1a 水平均降低(P＜0.05 或P＜0.01)。與對(duì)照組比較，刺山柑組、灸療組和綜合組HIF-1a 水平均降低(P＜0.05或P＜0.01)。見表3。

表3 各組血清HIF-1a比較/(μg/L)

2.5 各組大鼠滑膜組織sICAM-1、VEGF 蛋白表達(dá)的比較與空白組比較，對(duì)照組和模型組slCAM-1的蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。與模型組比較，治療組的slCAM-1 表達(dá)均降低(P＜0.01)，與對(duì)照組比較，刺山柑組與綜合組slCAM-1 蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與空白組比較，模型組和對(duì)照組VEGF蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05，P＜0.01），與模型組比較，治療組VEGF 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），灸療組和綜合組更為明顯。見表4、圖1。

表4 各組大鼠滑膜組織sICAM-1、VEGF蛋白表達(dá)的比較/(μg/L)

圖1 每組大鼠滑膜組織VEGF蛋白表達(dá)比較

3 討論

刺山柑為一種多年生灌木植物，根深大約30～100 cm，多刺，耐受惡劣環(huán)境[10]。刺山柑未熟的蓓蕾、果子和芽除被用于烹調(diào)以外，還發(fā)現(xiàn)具有廣泛的醫(yī)學(xué)用途，常用于治療風(fēng)濕、心血管和消化道等疾病[11]。刺山柑花、根可治療肝腎疾病；刺山柑花可治療癱瘓；刺山柑可治療糖尿病；刺山柑的根和樹皮可治療脾腫大、精神障礙、營(yíng)養(yǎng)不良等[12]。多種生物活性物質(zhì)的存在使刺山柑具備多種藥理活性，如消炎、降糖、降血脂等[13]。此外，刺山柑常作為治療RA 藥物，外敷法多用于治療關(guān)節(jié)炎[14]。

RA 屬中醫(yī)“痹證”范圍，本病多因平素營(yíng)衛(wèi)失調(diào)、氣血虧虛并復(fù)感外邪,致使虛實(shí)夾雜,久病難愈[6]。艾灸可活血化瘀，是治療RA 的傳統(tǒng)中醫(yī)方法之一[15]；它能有效調(diào)節(jié)RA模型動(dòng)物血清TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6含量，從而減少炎性反應(yīng)，減輕病變關(guān)節(jié)腫脹[16]。艾灸不僅起到消腫等作用，且經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)潔[17]，沒有毒副作用，能夠改善患者痛苦[18]。

腎俞穴可緩解骨骼疼痛，補(bǔ)腎益精，使腎陰腎陽充盈，骨髓得以滋養(yǎng)，利于關(guān)節(jié)經(jīng)脈通利。足三里具有補(bǔ)中益氣、調(diào)暢氣機(jī)，舒經(jīng)活絡(luò)之效。故艾灸治則以足陽明經(jīng)之合穴足三里保護(hù)脾胃為主，配以腎俞補(bǔ)腎益氣為標(biāo)，溫經(jīng)通絡(luò)除濕，標(biāo)本兼治[19]。溫和灸腎俞、足三里能減少RA滑膜細(xì)胞的増殖與排出[20]。

VEGF 作為調(diào)節(jié)血管生成因子，在RA 血管翳形成中起重要作用，它能夠促進(jìn)血管通透性，使內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，產(chǎn)生趨化性和毛細(xì)血管高通透性，因此參與炎癥的發(fā)展[21]。它與VEGF 受體聯(lián)合，可在炎癥或氧分壓低的情況下促使生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的分泌，病理性新生血管形成。新生血管就是滑膜血管翳的主要部門，關(guān)節(jié)液的營(yíng)養(yǎng)因血管翳包裹著軟骨而無法吸收，導(dǎo)致軟骨破壞、血管翳對(duì)骨的侵蝕增加[22]。slCAM-1 作為一種可介導(dǎo)細(xì)胞黏附作用的糖蛋白，使滑膜內(nèi)皮小靜脈被血液中白細(xì)胞所黏附，引起周圍炎癥從而造成滑膜炎[23]。

綜上，刺山柑風(fēng)濕止痛貼和溫和灸都能使RA 大鼠的炎癥反應(yīng)明顯減輕，而刺山柑風(fēng)濕止痛貼聯(lián)合溫和灸效果更為明顯，其作用機(jī)制可能與下調(diào)VEGF水平，抑制slCAM-1蛋白而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。