趙 倩，吐魯洪·沙列爾

（新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，烏魯木齊 830011）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，截止2018年全球約有200萬新診斷的女性乳腺癌病例，占女性癌癥病例的1/4[1]。根據國家癌癥中心發(fā)布的《2017 年中國腫瘤現(xiàn)狀和趨勢》，女性乳腺癌死亡率在女性最常見的惡性腫瘤中排名第六[2]。乳腺癌嚴重威脅著女性健康，因此尋找便捷且高效乳腺癌診斷標志物，對乳腺癌的防治具有重要意義[3-4]。非編碼RNA 是指序列上缺乏明顯的開放讀碼框，不具有編碼蛋白能力的一類RNA，包括長鏈非編碼RNA(lncRNAs)、環(huán)狀RNA(Cir-cRNAs)和微小RNA(miRNAs)[5]。作為一種重要的癌癥靶向標記物中，長鏈非編碼的RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在乳腺癌中的相關研究越來越多[6]。lncRNA 是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA[7]，最近的系統(tǒng)基因組學研究揭示，其主要通過調控表觀遺傳學轉錄及轉錄后水平的基因表達，廣泛參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，但是其生物功能和作用機制尚待闡明。lncRNA 中有的發(fā)揮促癌作用，有的發(fā)揮抑癌作用，在乳腺癌的研究中，很多l(xiāng)ncRNA被鑒定為致癌因子，很少被鑒定為抑制腫瘤的lncRNA，它們參與腫瘤細胞的生長、凋亡、遷移與侵襲，因此這種新型的RNA 可以作為診斷和預后的生物標記物，也可以作為潛在的治療靶標[8-9]?；蛐酒鳛橐环N高效、大規(guī)模的生物信息學技術，可檢測和分析腫瘤組織與正常組織之間差異表達的基因，為篩選新的腫瘤標志物提供機會[10]。本研究以乳腺癌為研究對象，利用基因芯片對乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA 進行全面分析，以篩選差異表達的lncRNA，并探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及潛在功能，為尋找乳腺癌早期診斷標記物提供理論依據與方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018 年9 月—11 月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院5 對女性乳腺癌組織及其癌旁正常組織（距腫瘤大于5 cm）標本，所有患者均經病理學診斷，術前未進行放、化療等治療?；颊吣挲g31～67歲，中位年齡51 歲。該研究已通過新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查（審批號：K2019003），并已獲得患者的知情同意。

1.2 試劑與儀器紫外分光光度計（Nano Drop ND-1000）購自美國Nanodrop 公司，Trizol 試劑（Invitrgen），RNA 6000 Nano Lab-on-a chip 試劑盒和生物芯片分析系統(tǒng)2100 Bioanalyzer購自美國Agilent公司。

1.3 芯片制備由北京博奧晶典生物技術有限公司定制的Capital Bio Technology Human LncRNA Array V4,4×180K 芯片，檢測人物種的基因表達譜，每個陣列包含41 000個lncRNA 檢測探針和34 000個mRNA探針。

1.4 方法

1.4.1 RNA 提取、標記與雜交 根據試劑說明書，按照Trizol 法提取乳腺癌組織及癌旁正常組織中的總RNA，用紫外分光分度法測定總RNA 濃度和純度，計算光密度（optical density，OD）OD260/OD280 值，抽提所得RNA 經安捷倫生物分析儀2100 Bio analyzer 電泳質檢合格后備用。

1.4.2 芯片實驗 本研究所選用的芯片為人4×180 K芯片，共10 個標本，需要完成10 張上述芯片。具體步驟如下：（1）RNA 的擴增和標記；（2）芯片雜交：按照Agilent 雜交標準流程和配套試劑盒將互補RNA（cRNA）產物與lncRNA芯片進行。（3）芯片掃描：完成雜交的芯片用安捷倫微陣列掃描儀進行掃描。使用逆轉錄試劑盒對RNA 逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA）并進行純化，體外轉錄成cRNA，對cRNA 產物進行熒光標記。以cRNA 為模板，用CbcScriptⅡ酶，隨機引物（random primer）進行反轉錄。純化回收反轉錄得到的cDNA 并定量。以反轉錄的cDNA 產物為模板，用Klenow Fragment 酶，隨機引物（random primer），合成cDNA 互補鏈并摻入帶有熒光基團的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）（單通道為Cy3-dCTP，雙通道為Cy3-dCTP 和Cy5-dCTP），純化并定量標記產物。帶有熒光基團DNA即可用于芯片雜交。

1.4.3 差異表達基因功能及通路富集分析 利用生物學信息注釋數據庫（DAVID）對差異基因進行基因本體(gene ontology，GO)生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，富集標準為P＜0.05。

1.5 統(tǒng)計學處理對10張芯片的數據進行匯總和歸一化。通過使用Gene Spring軟件V13.0（Aglient）進行質量控制，選擇差異表達的基因。差異表達lncRNA的篩選標準為差異倍數（FC）≥2倍，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 篩選差異表達lncRNA乳腺癌組織與癌旁組織相比，乳腺癌組織中具有2 倍（|log2FC|＞1）以上差異的lncRNA 有1 150 條，其中上調的lncRNA 有551條，下調的lncRNA 有599 條。下調lncRNA 差異最顯著的為XR＿159043.1（FC=26.878，P＜0.05），上調的lncRNA 差異最為顯著的是ENST00000427451.1（FC=11.478，P＜0.05），選取顯著高表達的lncRNA 進行列表，見表1。

表1 乳腺癌組織中顯著差異表達lncRNA

2.2 聚類分析對篩選的lncRNA進行聚類分析結果顯示，同組的樣本聚類在一起，說明樣本間基因表達的趨勢是一致的，見圖1。

圖1 乳腺癌差異表達的lncRNA聚類分析

2.3 lncRNA 參與的生物信息學功能分析通過GO 富集發(fā)現(xiàn)，lncRNA廣泛參與多種生物學進程，包括RNA加工、mRNA 代謝過程、mRNA 加工、RNA 剪接、基因表達等，見圖2。KEGG 信號通路分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與了PI3K-AKT、RIG-I 樣受體信號通路，參與了癌癥中的轉錄失調、病毒感染、雌激素信號通路等進程，見圖3。

圖2 GO富集分析乳腺癌中差異表達的lncRNAs

圖3 KEGG信號通路分析乳腺癌中差異表達的lncRNAs

2.4 差異表達lncRNA 靶基因預測差異表達lncRNA共有119 種靶基因，列舉的20 種靶基因對應的lncRNA，見表2。

表2 20種靶基因對應的lncRNA

3 討論

目前，人們在不斷尋找能夠作為乳腺癌診斷的生物學標志物和相關的治療靶點[11]。蛋白質編碼序列包含20 000 多個蛋白編碼基因，占基因組總數不超過2%，大多數人類基因的轉錄子是長鏈非編碼RNA[12]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA 在腫瘤的形成和進展中起重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織和正常組織中有一系列的差異表達lncRNA，這些差異表達的lncRNA 有可能作為腫瘤診斷的標志物，甚至可以預測患者預后[13-15]。近年來隨著分子醫(yī)學的迅速發(fā)展，生物信息學成為探尋疾病診斷和治療的主要方法與手段。基因芯片技術以其高通量、大規(guī)模檢測腫瘤基因，并且具有自動化、靈敏度高、速度快等優(yōu)點而被廣泛應用于各個領域[16]。因此本研究采用基因芯片測序檢測5 對乳腺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織，進一步分析差異表達的lncRNA 結果顯示，乳腺癌組織中具有2 倍（|log2FC|＞1）以上差異的lncRNA 有1 150 條，其中上調的lncRNA 有551條，下調的lncRNA 有599 條。通過原始數據用軟件歸一化后，利用差異表達位數以及t檢驗統(tǒng)計方法進行差異篩選基因，將篩選所得的差異基因，通過聚類熱圖的方法，對結果進行了直觀的圖形展示，這說明乳腺癌組織和癌旁組織多基因表達量的聚類關系。

GO 分析和KEGG 通路分析也可為乳腺癌中相關基因和基因產物提供一定信息基礎，并進一步說明乳腺癌中的相關基因和基因產物。本研究采用GO和KEGG 通路分析生物學功能發(fā)現(xiàn)，差異表達基因參與多種生物過程、細胞組織成分和分子功能有關。通過GO 分析發(fā)現(xiàn)，差異表達lncRNA 具有豐富的生物學功能，包括有核酸轉運、RNA 加工等過程。而信號通路方面，PI3K-AKT 信號通路先前已被證實在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，超過70%的乳腺癌患者至少存在一種該通路成分的改變[17]。這條通路最主要的基因變異是PTEN 基因活性缺失、PI3KAKT 激活點的突變以及AKT 的突變。本研究對5 對乳腺癌和癌旁組織差異表達的lncRNA 進行檢測，發(fā)現(xiàn)與乳腺癌有關的信號通路有PI3K-AKT 信號通路，與相關研究結果一致。

通過生物信息學的方法，可為篩選腫瘤相關lncRNA 提供一個方便快捷的途徑，為尋找腫瘤新型標志物提供新的思路。越來越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)存在異常表達的lncRNA。作為第一個被發(fā)現(xiàn)的lncRNA H19，在乳腺癌中H19 的過表達促進腫瘤的發(fā)展，在乳腺癌細胞的增殖、轉移、化學耐藥性和干細胞維持中起重要作用。相關研究證實，H19在乳腺癌組織和細胞中上調，并且與乳腺癌預后相關[18]。也有研究表明，H19 在雌激素受體（ER）陽性乳腺癌中比在ER 陰性乳腺癌組織中含量更高[19]。在乳腺癌中，HOX 轉錄反義RNA（HOTAIR）是目前較多的lncRNA 之一。HOTAIR 基因的啟動子包含多個雌激素反應原件，并在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中雌二醇轉錄激活，HOTAIR 與乳腺癌1 號基因（BRCA1）競爭，它介導了Myc 原癌基因（c-Myc）的致癌作用。HOTAIR 最重要的作用是參與癌癥的進展，其過度表達會刺激癌細胞侵襲和轉移[20]。另外，HOTAIR 可通過與自噬基因特有的mRNA 相互作用，調節(jié)自噬，這對于乳腺癌的發(fā)展至關重要[21]。

綜上所述，本研究通過生物芯片和生物信息學技術發(fā)現(xiàn)了乳腺癌患者中差異表達的lncRNA，但差異表達的lncRNA數量較多，而且功能未知，今后應逐一進行差異表達lncRNA 的功能驗證，分析其與乳腺癌的相關性，進一步探討其在乳腺癌發(fā)病機制中的作用。