于永樂，姚延珠，韓先杰，張傳美，秦志華，楊瑞梅，張洪亮，劉維全，單 虎*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，青島 266109；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

犬源牛犬細(xì)小病毒(canine bocavirus, CBoV)屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)、牛犬細(xì)小病毒屬(Bocaparvovirus)的成員，為單鏈線狀DNA病毒，CBoV的基因組大小約為5.4 kb，在結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)之外存在第三個(gè)開放閱讀框，編碼NP蛋白[1-3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種不同亞型的犬源牛犬細(xì)小病毒，即CBoV-1、CBoV-2和CBoV-3[4-7]。

犬圓環(huán)病毒(canine circovirus, CCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的成員，基因組為環(huán)狀單鏈DNA，包含兩個(gè)大的開放閱讀框，其中，一個(gè)編碼Rep蛋白，另一個(gè)編碼Cap蛋白[8]。CCV往往導(dǎo)致腸炎、肺炎、壞死性血管炎等相關(guān)疾病，但是在健康犬的糞便中也發(fā)現(xiàn)了該病毒的存在，因此，迄今為止，對(duì)于CCV的致病機(jī)制尚不清楚[9]。

CBoV和CCV均可以導(dǎo)致犬腹瀉相關(guān)疾病，在我國(guó)已有多篇報(bào)道，但能同時(shí)檢測(cè)上述兩種病原的多重PCR檢測(cè)方法尚未見報(bào)道。本研究成功建立了可同時(shí)檢測(cè)CBoV和CCV的二聯(lián)PCR診斷方法，并對(duì)山東地區(qū)送檢的病料進(jìn)行了實(shí)際驗(yàn)證，證實(shí)了該方法的可靠性，可用于臨床樣品的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)毒株及質(zhì)粒

犬細(xì)小病毒2a亞型(canine parvovirus type 2a, CPV2a)CPV-QN5株、犬瘟熱病毒(canine distemper virus, CDV)CDV-QN1株及犬副流感病毒(canine parainfluenza virus, CPIV)CPIV-QN1株均由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

質(zhì)粒：pMD-CBoV-NS1和pMD-CCV-Rep均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存，將質(zhì)粒濃度調(diào)整為30 ng·μL-1。

1.2 臨床病料

送檢的病料來自山東某地養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病犬肛拭子，共計(jì)30份。按照1∶9的比例加入滅菌PBS緩沖液充分振蕩溶解，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

D1000 plus DNA Ladder、2×primeSTAR Max Premix購自北京寶生物(TaKaRa)工程有限公司；QIAEX II膠回收試劑盒購自上海玉博生物科技公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自艾德萊生物科技有限公司。

1.4 二聯(lián)PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中CBoVNS1基因和CCVRep基因序列，利用Primer Primier 5軟件，設(shè)計(jì)兩對(duì)二聯(lián)PCR引物，引物由青島志遠(yuǎn)生物工程有限公司合成，引物序列：CBoV-P1(5′-GTGATGGGCGGTGACGGCTTGA-3′)，CBoV-P2：(5′-CTGGTAGA-CGCAGCCGATGAGA-3′)；CCV-P3(5′-GAAAA-TGGTGGGACGGTTACGAT-3′)，CCV-P4(5′-CAAAGTGAGACGCCGATAGAGGG-3′)；上述引物預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小分別為170(CBoV)和239 bp(CCV)。

1.5 病料DNA模板制備

分別將CBoV和CCV的臨床病料300 μL置于離心管中，沸水浴 10 min 后，迅速冰浴2 min，然后用微量離心機(jī)于室溫以 8 500 r·min-1離心6 min，吸取上清液用于后續(xù)PCR反應(yīng)。

1.6 二聯(lián)PCR擴(kuò)增方法的建立及優(yōu)化

所有PCR反應(yīng)總體積為25 μL,其中，2×primeSTAR Max Premix 12.5 μL，不同引物終濃度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol·L-1)，質(zhì)粒模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR條件為98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，不同退火溫度(52、54、56、58、60 ℃)退火10 s，72 ℃延伸10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察并照相，確定其最適引物濃度和退火溫度，并對(duì)所有擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，目的片段送公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.7 二聯(lián)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)

在二聯(lián)PCR反應(yīng)體系中，各病毒引物終濃度：CBoV 0.10 μmol·L-1、CCV 0.20 μmol·L-1。二聯(lián)PCR反應(yīng)退火溫度確定為58 ℃，其他條件與“1.6”一致，分別對(duì)上述質(zhì)粒模板進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 二聯(lián)PCR重復(fù)性、特異性和敏感性試驗(yàn)

按照“1.7”的方法，進(jìn)行二聯(lián)PCR重復(fù)性和特異性檢測(cè)。將CBoV與CCV質(zhì)粒的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍稀釋度的DNA模板組合，進(jìn)行二聯(lián)PCR靈敏度檢測(cè)。

1.9 二聯(lián)PCR對(duì)送檢病料的檢測(cè)

以已建立的二聯(lián)PCR對(duì)送檢的30份病料進(jìn)行檢測(cè)，并與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 二聯(lián)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)

由圖1可知，應(yīng)用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和條件，二聯(lián)PCR一次性成功擴(kuò)增出170 bp(CBoV)和239 bp(CCV)的2條目的條帶(圖1)，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，所有擴(kuò)增的片段與CBoV和CCV相應(yīng)基因序列高度一致。

圖1 二聯(lián)PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 二聯(lián)PCR重復(fù)性、特異性和靈敏度

由圖2A可知，二聯(lián)PCR重復(fù)3次均可以獲得一致的擴(kuò)增結(jié)果，而且與犬相關(guān)的3種病毒——CPV-2、CDV和CPIV檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證明該方法具有很高的特異性(圖2B)；靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，二聯(lián)PCR至少可檢出約3.0 pg DNA(圖2C)。

A～C.重復(fù)性、特異性和靈敏度試驗(yàn)結(jié)果；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；ddH2O.陰性對(duì)照；10-1～10-6.稀釋度

2.3 二聯(lián)PCR對(duì)臨床病料的檢測(cè)

在30份送檢樣品中，應(yīng)用二聯(lián)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，其中，CBoV陽性4份，CCV陽性3份。與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致(圖3)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～30.樣品；ddH2O.陰性對(duì)照；P.陽性對(duì)照

3 討 論

CBoV和CCV是導(dǎo)致犬腹瀉病的兩種重要病原體，在我國(guó)已有多篇報(bào)道，但目前對(duì)于兩種病毒的致病機(jī)制及流行情況尚不清楚，因此建立快速診斷方法，加強(qiáng)對(duì)兩種新發(fā)病原的檢測(cè)十分必要。陳意偉等[10]于2016年首先建立了CBoV的PCR檢測(cè)方法，曹亮等[11]于2017年建立了可同時(shí)檢測(cè)犬圓環(huán)病毒和犬細(xì)小病毒的雙重PCR檢測(cè)方法，以上研究對(duì)兩種病毒的流行情況均進(jìn)行了詳細(xì)的描述。Niu(牛江婷)等[12]報(bào)道在1只貓糞便中檢測(cè)到CBoV的核酸，經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)貓?jiān)碈BoV與犬源CBoV具有相同的基因結(jié)構(gòu)，提示CBoV已經(jīng)具有了跨物種傳播的能力，因此，加強(qiáng)對(duì)CBoV的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)十分必要。而且近年來CCV感染的報(bào)道也逐漸增多，從重慶[13]到黑龍江[14]均有不同程度病例出現(xiàn)，可見CCV流行范圍較廣。此外，一種新發(fā)病原豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus 3，PCV 3)在犬的腹瀉及血清樣本中檢到[15]，提示在對(duì)犬臨床樣本檢測(cè)過程中，也要增加對(duì)PCV 3等跨宿主感染和傳播的病原進(jìn)行檢測(cè)，才能獲得更加準(zhǔn)確的研究結(jié)果。

隨著CBoV與CCV感染的病例不斷出現(xiàn)[7]，迫切需要更加快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法用于臨床實(shí)際，而且國(guó)內(nèi)尚未有CBoV和CCV二聯(lián)PCR檢測(cè)方法的報(bào)道，限制了對(duì)兩種新發(fā)犬腹瀉病的流行情況的監(jiān)測(cè)。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，通過多重序列比對(duì)、反應(yīng)體系及條件優(yōu)化，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后建立了更加簡(jiǎn)便快捷的雙重PCR方法，其操作簡(jiǎn)單，靈敏度更高，可完全滿足臨床檢測(cè)要求。

4 結(jié) 論

成功建立了可同時(shí)檢測(cè)犬源牛犬細(xì)小病毒(CBoV)和犬圓環(huán)病毒(CCV)的二聯(lián)PCR檢測(cè)方法，方法的最低檢測(cè)限度為3.0 pg總DNA，對(duì)犬細(xì)小病毒2型、犬瘟熱病毒和犬副流感病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。臨床樣品檢測(cè)顯示，可用于臨床犬腹瀉病的流行病學(xué)調(diào)查。