周 軻，牛 淳，劉文娟，姚萬玲，紀 鵬，華永麗，魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

脾虛泄瀉是指因脾陽氣虛而致運化失常、作瀉，多表現(xiàn)為腹瀉、久瀉不愈、時瀉時止或完谷不化、食欲不振、消瘦或乏力等[1]。獸醫(yī)臨床上，脾虛泄瀉多因飼養(yǎng)寒涼食物、饑飽失常、過度使役、環(huán)境性應激等造成，為獸醫(yī)臨床常見病證之一，通常會導致動物食欲低下，消化不良，使動物體重下降，抵抗力降低繼發(fā)其他疾病，嚴重者可導致死亡，對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成一定的經(jīng)濟損失。

動物百會穴的定穴與人不同。人的百會穴定于后發(fā)際正中上7寸，兩耳尖直上頭頂正中[2]，而動物的百會穴定于腰薦十字處，即最后腰椎與第一薦椎棘突間的凹陷中，但都處于督脈循行路線上。動物百會穴主要用于治療腰胯疾病[3]。據(jù)文獻報道，白針或水針百會穴對腰胯損傷、后肢麻痹及馬的破傷風有一定的治療效果[4-6]。但有關針刺百會穴治療家畜脾胃泄瀉等疾病的研究鮮有報道，僅王魯?shù)萚7]電針百會穴來進行抗腹瀉試驗，發(fā)現(xiàn)電針百會穴對治療仔豬腹瀉具有良好療效。脾虛泄瀉多與消化道中下部有密切聯(lián)系，而消化道中下部與百會穴解剖位置較接近，利用近治取穴的原則[3]，可選取該穴治療脾虛泄瀉。其次督脈可督一身之陽氣，脾虛泄瀉時中陽不健、運化無權，針灸督脈之穴，可扶正機體陽氣。因此百會穴可作為治療脾虛泄瀉的重要穴位。

本研究用灌胃番瀉葉的方法建立脾虛泄瀉動物模型，以電針百會穴的方法進行治療，通過觀察臨床癥狀，測定脾、胰的器官指數(shù)及檢測胃腸吸收能力和炎癥因子變化情況來評價電針百會穴對脾虛泄瀉的治療作用，為獸醫(yī)臨床治療脾虛泄瀉提供一種方便快捷的針灸治療方法，也為進一步研究百會穴的功效以及發(fā)揮功效的機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料與試劑

1.1.1 試驗藥品 番瀉葉購自蘭州惠仁堂藥業(yè)銀灘雅苑店，處理方法：將1 kg番瀉葉加入到5 L沸水中，浸泡30 min，紗布過濾得到浸泡液，將浸泡液用蒸餾水定容至5 L，得到質量濃度為0.2 g·mL-1的番瀉葉浸液。浸液置于4 ℃冰箱備用。天然蒙脫石散(生產(chǎn)批號：F25551)購自博福-益普生(天津)制藥有限公司。

1.1.2 試驗試劑 D-木糖試劑盒(貨號：A035)購自南京建成生物工程研究所，D-木糖(貨號：SX8030)購自索萊寶科技有限公司，大鼠淀粉酶ELISA試劑盒(貨號：ml059302)、大鼠IL-12 ELISA試劑盒(貨號：ml622111)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，大鼠IL-2 ELISA試劑盒(貨號：ERC001.96)、大鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒(貨號：ERC102a.96)均購自欣博盛生物科技有限公司。

1.1.3 試驗儀器 YP502 N電子天平(上海天美天平儀器有限公司)，BSA224S-CW分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，KWD-808I脈沖電療儀(常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司)，Spectra Max Plus384酶標儀(美谷分子儀器有限公司)，752 N紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組 64只Wistar大鼠，雌雄各半，體質量180～200 g，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，合格證號SCXK(甘)2021-0001，室溫自然光照環(huán)境，標準飲食，自由飲水。適應性飼養(yǎng)3 d后分成假手術組(sham operated group，Sham)，百會組(electric acupuncture Baihui group, Baihui)，模型組(model group，Model)和陽性對照組(positive control group，PC)。

1.2.2 動物模型建立及治療 造模方法在徐海珍等[8]、周鴻雲(yún)等[9]、彪雅寧等[10]基礎上加以改良調整。模型組、百會組、陽性對照組分別在中午12：00和晚上24：00各灌胃1次番瀉葉浸液(0.2 g·mL-1)，按體質量以10 μL·g-1計算用量；假手術組灌胃相應體積(按體質量以10 μL·g-1計)生理鹽水。第5天，造模各組大鼠普遍出現(xiàn)腹瀉、糞便稀溏、精神萎靡等癥狀，提示造模成功。造模成功后，仍按照上述方法持續(xù)灌胃番瀉葉浸液至第18天。百會組從第5天開始，每天早上9：00—11：00，將其固定在大鼠固定架上，并電針百會穴(刺入深度為3～5 mm，針尖5 mm處纏繞透明膠帶，保證入刺深度趨于一致)連續(xù)波刺激，基礎電強度為2級，其余調為4級左右，以大鼠微微顫抖為標準，針刺激15 min。陽性對照組灌胃蒙脫石散懸濁液(濃度為40 mg·mL-1，用量20 μL·g-1)。假手術組和模型組每天在大鼠固定架上固定15 min直至第19天。

1.2.3 樣本采集 第18天給藥結束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，第19天解剖前1 h灌胃5% D-木糖2 mL。水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，置于室溫制備血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?；采血致死后剖取脾、胰腺?/p>

1.2.4 一般行為學觀察 試驗中每天觀察大鼠的一般狀態(tài)，如精神狀態(tài)、活動狀態(tài)、生長體態(tài)、被毛、飲食欲、肛周、糞便等，并加以記錄。

1.2.5 腹瀉指數(shù) 記錄奇數(shù)天每只大鼠出籠1 min內的排便次數(shù)及稀便等級。計算方法根據(jù)國際通用標準，腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便等級。稀便率按照稀便次數(shù)/排便次數(shù)來計算。稀便等級按照稀便最小直徑分為4級，小于1 cm為1級，1～2 cm為2級，2～3 cm為3級，稀便最小直徑大于3 cm的為4級。

1.2.6 體質量測定 奇數(shù)天對大鼠進行稱重，稱重需在拉尾排便試驗結束后，去除排便減重的干擾，對大鼠進行3次體質量的測量，取平均值。

1.2.7 臟器指數(shù)的測定 摘取脾、胰腺，剔除多余結締組織，用分析天平測定其質量。計算脾及胰腺的器官指數(shù)。計算公式：臟器指數(shù)=器官質量/動物體質量×100%。

1.2.8 血清AMS和D-木糖的檢測 取出-80 ℃下保存的血清，室溫下解凍，嚴格按照試劑盒的說明，進行AMS和D-木糖檢測。

1.2.9 血清炎性因子的測定 取出-80 ℃下保存的血清，室溫下解凍，嚴格按照試劑盒說明，進行血清IL-2、IL-12及TNF-α的測定。

2 結 果

2.1 一般行為學變化

造模前，所有大鼠精神狀態(tài)良好、活潑好動，被毛光滑潔白，食欲良好，糞便成型，肛周潔凈。試驗第13天(治療一周后)，模型組大鼠體型消瘦，神情呆滯，被毛雜亂，不愿走動，排水樣稀便，稀便常黏附于肛周及尾巴，百會組一般行為學表現(xiàn)有所好轉，肛周污穢減少，糞便濕潤。陽性對照組糞便稀軟(圖1)。而百會組和陽性對照組大鼠狀態(tài)逐漸恢復，通過2周的治療，百會組和陽性對照組一般行為學與假手術組趨于一致。

圖1 第13天各組大鼠的腹瀉情況

2.2 電針百會穴對脾虛泄瀉動物體質量的影響

與假手術組相比，從第3天開始，模型組雄性大鼠體質量變化率在奇數(shù)天均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；雌性大鼠在第9、13天模型組的體質量變化率顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，從第11 天開始，百會組雄性大鼠體質量變化率奇數(shù)天均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；雌性大鼠變化不顯著(P>0.05)。從電針百會穴第1天起，百會組和陽性對照相比雌雄大鼠體質量變化率均差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

A.雄性大鼠體質量變化率；B.雌性大鼠體質量變化率；模型組與假手術組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；百會組與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01

2.3 電針百會對脾虛泄瀉動物稀便及腹瀉指數(shù)的影響

從第5天起，模型組、百會組和陽性對照組均出現(xiàn)了持續(xù)性腹瀉癥。與假手術組相比，其他三組的腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)(圖3A)。第13天時，電針和藥物治療1周后，與模型組相比，百會組腹瀉指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，而陽性對照組和模型組差異不顯著(P>0.05)(圖3B)。第19天時，相較于模型組，百會組和陽性對照組腹瀉指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)(圖3C)。

2.4 電針百會穴對脾虛泄瀉動物胰腺和脾指數(shù)的影響

與假手術組相比，模型組的脾指數(shù)極顯著升高(P<0.01)，胰腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，百會組和陽性對照組的脾臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，胰腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組雌性大鼠的脾、胰腺指數(shù)

2.5 電針百會穴對脾虛泄瀉大鼠消化吸收功能的影響

與假手術組相比，模型組血清D-木糖含量極顯著降低(P<0.01)，陽性對照組的D-木糖含量顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，陽性對照組血清中D-木糖含量顯著升高(P<0.05)，百會組血清中D-木糖含量極顯著升高(P<0.01)。與陽性對照組相比，百會組血清中D-木糖的水平顯著上升(P<0.05)(圖4A)。與假手術組相比，模型組淀粉酶含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，百會組和陽性對照組淀粉酶含量均顯著上升(P<0.05)(圖4B)。

A.D-木糖；B.淀粉酶。與假手術組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01；百會組與陽性對照組相比，+.P<0.05

2.6 電針百會對脾虛泄瀉動物血清炎性因子的影響

與假手術組相比，模型組IL-2含量極顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，百會組和陽性對照組的IL-2含量均極顯著降低(P<0.01)(圖5A)。與假手術組相比，模型組IL-12含量顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，百會組IL-12含量顯著降低(P<0.05)，陽性對照組IL-12含量極顯著降低(P<0.01)(圖5B)。與假手術組相比，模型組TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，百會組和陽性對照組TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)(圖5C)。百會組和陽性對照組的血清IL-2、IL-12和TNF-α均差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

A.IL-2；B.IL-12；C.TNF-α。與假手術組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01

3 討 論

百會穴在獸醫(yī)上常用來治療腰胯損傷，后肢麻痹等；人醫(yī)臨床中，此解剖部位穴位多用于治療婦科疾病，如月經(jīng)不調、疼痛等病癥。關于針刺此穴治療泄瀉報道較少。中獸醫(yī)臨床上對脾虛泄瀉常用參苓白術散或其衍生方來治療，針灸治療通常選取后三里、脾俞為主穴，以及脾、胃經(jīng)絡的穴位為配穴[11]。作者前期預試驗研究發(fā)現(xiàn)，電針后三里、脾俞、百會穴對脾虛泄瀉治療效果確切。而百會穴相較于其他穴位定穴簡單、操作簡便、不易溜針，更適合應用于臨床治療。作者通過電針百會穴的確切療效可對臨床治療脾虛泄瀉的針灸療法，提供一定的選穴依據(jù)。

本研究中，脾虛泄瀉大鼠表現(xiàn)出食欲降低，腹痛，觸摸后閃躲，精神萎靡，四肢無力，尤以腹瀉次數(shù)增加，排水樣稀便，肛周黏附糞便污漬，被毛雜亂無光澤等癥狀為主。百會組電針百會穴治療1周后大鼠食欲明顯改善，精神狀態(tài)稍有好轉，活動范圍增大且腹瀉次數(shù)明顯降低。治療2周后，狀態(tài)與假手術組接近。從癥狀體征上來看，成功建立了大鼠脾虛泄瀉模型，且電針百會穴可以緩解脾虛動物的臨床癥狀。脾虛泄瀉對大鼠體質量也具有重要的影響。徐俊[12]曾把體質量下降定義為脾虛泄瀉模型建立成功的標志，脾虛泄瀉動物體質量下降是因為大鼠食欲下降，采食量降低；另外腹瀉造成腸胃蠕動加快，營養(yǎng)物質吸收不良，致體質量降低。但本試驗結果表明，脾虛模型組雄性大鼠全程和第9與13天的雌性大鼠體質量增長率下降，與該報道結果不完全一致。雌性大鼠體質量沒有全程增長率下降，這可能是由于不在雌鼠生長發(fā)育最明顯階段或雌鼠天然抵抗力較強或其他因素導致。因此，脾虛泄瀉的判定僅靠體質量下降不夠全面，應考慮性別原因，并結合其他癥狀體征綜合判斷。

腹瀉指數(shù)因其能很好地描述動物個體腹瀉情況，常用作評價腹瀉程度的國際指標[13]。本試驗前期動物出現(xiàn)了大范圍腹瀉，電針百會穴治療1周后(第13天)，百會組的腹瀉指數(shù)較模型組明顯下降，表明電針百會穴對腹瀉起到了一定的緩解作用。治療2周后(第19 天)，腹瀉指數(shù)降為0，表明電針百會穴可有效緩解脾虛泄瀉大鼠腹瀉癥狀，這與施旭光等[14]、肖怡等[15]報道的脾虛泄瀉模型建立后及藥物治療后腹瀉指數(shù)變化趨勢一致。

中(獸)醫(yī)學的脾包括現(xiàn)代解剖學中的脾和胰腺[16-17]。本研究結果顯示，脾虛泄瀉時，會導致雌性大鼠的脾指數(shù)顯著增大，胰腺指數(shù)顯著減小，這與藺曉源等[18]報道的脾虛泄瀉動物脾增大相一致。說明脾、胰功能及形態(tài)發(fā)生了改變，這可能是由于脾虛泄瀉時炎性細胞浸潤而使脾發(fā)生了代償，胰腺指數(shù)下降可能是由于胰腺發(fā)生萎縮，這與本研究中胃腸消化吸收功能減弱相一致。本研究未選用雄性大鼠的臟器指數(shù)數(shù)據(jù)是由于雄性大鼠體質量變化過大，臟器指數(shù)測量大多依賴體質量而發(fā)生偏差，導致測量結果不準確。通過電針百會穴降低了脾指數(shù)，提升了胰腺指數(shù)，從而恢復了脾和胰腺的功能狀態(tài)，進一步說明電針百會穴對脾虛泄瀉具有一定的治療作用。

多數(shù)學者認為D-木糖吸收試驗是一種重要且靈敏度較高的檢查胃腸吸收的方法[19-20]。主要是因為D-木糖吸收部位在小腸，其代謝不需要消化酶的參與，經(jīng)腎以尿液形式排出體外[21]。脾胃虛弱時小腸細胞膜表面的Na-K-ATP酶活性降低，小腸黏膜的吸收功能下降導致吸收D-木糖的能力降低[22]。AMS廣泛存在于唾液和胰腺中，發(fā)生脾虛泄瀉時，淀粉酶活性降低而導致消化不良[23]。本研究結果顯示，脾虛泄瀉模型組大鼠D-木糖及AMS水平降低，可能是由于泄瀉導致腸道吸收水平降低，而百會組D-木糖及AMS水平升高，說明電針百會穴上調了D-木糖及AMS水平，恢復了腸道的吸收功能。這與黃娟等[24]、張明等[25]關于脾虛泄瀉動物體內D-木糖及AMS變化結果一致。

脾虛泄瀉的產(chǎn)生通常伴隨炎癥因子的變化[26]。孫勝振等[27]發(fā)現(xiàn)使用蒼術和白術配伍對脾虛泄瀉動物體內炎性因子有較好的改善作用。長期腹瀉會損傷腸黏膜，引起機體產(chǎn)生炎癥反應，釋放炎性因子，導致機體內促炎因子水平升高[28]。IL-2能活化T細胞，促進細胞因子產(chǎn)生，并激活巨噬細胞，調節(jié)腸道炎癥環(huán)境。IL-2、IL-12都是促炎因子，IL-12可以促進TNF-α的釋放[29]。TNF-α在腸道中促進炎癥的發(fā)生，充當黏膜損傷介質并導致腸黏膜細胞結構的變化[30]。本試驗結果表明，電針百會穴可能是通過抑制了IL-12的表達水平，導致TNF-α水平降低，抑制了炎癥反應，從而緩解脾虛泄瀉模型動物體內炎癥反應，以治療脾虛泄瀉。

4 結 論

成功建立了脾虛泄瀉大鼠模型，電針刺激百會穴對脾虛泄瀉具有一定的治療效果，主要表現(xiàn)為緩解脾虛泄瀉的癥狀體征，增加體質量，緩解腹瀉，增強腸道消化吸收功能，降低機體的炎性反應。這為臨床治療脾虛泄瀉提供一種方便快捷的針灸方法，并為研究針刺百會穴可以治療脾虛泄瀉提供證據(jù)支持。