李兆龍，張惠芳，豐志華，方 舟

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福州 350015)

豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)是皰疹病毒科(Herpesviridae)皰疹病毒屬的一個(gè)重要成員[1]，宿主范圍較廣，可感染不同年齡的豬、牛、綿羊、犬、貓、水貂、雪貂、小鼠、大鼠、豚鼠等。豬偽狂犬病在我國(guó)生豬養(yǎng)殖中發(fā)病率較高。此外，不同日齡段豬感染后所表現(xiàn)的臨床癥狀不一樣，幼齡豬感染后死亡率接近70%，成年母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎或產(chǎn)木乃伊胎兒等，公豬則主要表現(xiàn)為精子的活力低，或精子數(shù)量少等。該病無(wú)季節(jié)性，各個(gè)季節(jié)均會(huì)發(fā)生。目前，雖然我國(guó)成熟商品化疫苗多，但因病毒變異快，因此疫苗的預(yù)防效果總體不甚理想，生豬的野毒陽(yáng)性率仍然較高，損失較為嚴(yán)重[2-4]。

PRV病毒粒子呈正二十面體，直徑為150～180 nm[5]。它的基因組較大，約為143 kb，編碼約80個(gè)蛋白。PRV毒性蛋白主要是糖蛋白gE、gD、gI以及胸苷激酶(TK)的基因協(xié)同控制，其中TK基因?qū)RV的增殖、復(fù)制、潛伏感染及激活有重要的作用，因此TK基因是PRV的主要毒性基因，常作為治療及開(kāi)發(fā)疫苗的首選靶基因。而gE基因和gI結(jié)合在一起，促進(jìn)病毒入侵宿主細(xì)胞，因此，控制入侵的源頭也非常關(guān)鍵。由L48基因編碼的被膜蛋白VP16，通過(guò)與宿主的細(xì)胞因子Oct-1和HCF-1結(jié)合從而激活立即早期基因IE180的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)和病毒的增殖，它在病毒復(fù)制及裝配中執(zhí)行著非常重要的生物學(xué)功能[6-7]。因而，VP16也是基因靶向治療的關(guān)鍵所在。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個(gè)高效的基因編輯系統(tǒng)，能精確靶向編輯目的基因，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究[8]。它不僅對(duì)動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌和病毒能進(jìn)行實(shí)時(shí)靶向編輯，而且能夠用于動(dòng)物和部分人的胚胎基因編輯[9-10]。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)于遺傳性疾病的治療也有很好的應(yīng)用前景，之前的研究證實(shí)該系統(tǒng)可用來(lái)治療亨廷頓氏病(huntingtin基因突變引起的疾病)的小鼠，矯正了嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease, SCID)的致病突變等[11-12]。

腺聯(lián)病毒(adeno-associated virus，AAV)是單鏈復(fù)制缺陷型DNA病毒，它的宿主范圍廣，能感染分化成熟的細(xì)胞和分化未成熟的細(xì)胞，也能轉(zhuǎn)導(dǎo)不同分裂期的細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于疾病的基因治療和轉(zhuǎn)基因研究等[13]。目前，AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)于多種疾病的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，它很有可能成為世界上第一個(gè)上市的基因治療藥物載體。目前的研究表明，AAV的安全性高，通過(guò)加工后可口服，因此它是較為合適的基因治療載體[14-16]。

本研究利用重組腺聯(lián)病毒載體攜帶CRISPR/Cas9系統(tǒng)，靶向體內(nèi)感染的PRV關(guān)鍵毒力基因TK和gE，以及復(fù)制關(guān)鍵點(diǎn)的VP16基因，從而在源頭削弱PRV的毒力，并通過(guò)破壞它的復(fù)制相關(guān)基因，從而達(dá)到抑制或減弱它復(fù)制能力，進(jìn)而達(dá)到治療的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和細(xì)胞 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞來(lái)源于TaKaRa公司。pX601質(zhì)粒為Addgene產(chǎn)品;AAV2/5質(zhì)粒為Biovector公司產(chǎn)品；pHelper質(zhì)粒為廣州華韻生物科技有限公司產(chǎn)品，相關(guān)圖譜見(jiàn)圖1。pXTK、pXgE、pXVP16質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室制備。293A細(xì)胞來(lái)源于上海紀(jì)寧生物科技有限公司，ST細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，兩種細(xì)胞都是貼壁細(xì)胞，使用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基；PRV(Fa，閩A株)株來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)。

A.AAV2/5質(zhì)粒；B.pHelper質(zhì)粒；C.pX601質(zhì)粒

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 140只20 g左右的BALB/c小鼠，購(gòu)自吳氏動(dòng)物中心。所有的動(dòng)物試驗(yàn)嚴(yán)格按照福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心的動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定執(zhí)行(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)：FJSU3568423)。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9-sgRNA敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 sgRNA的設(shè)計(jì)與合成:從NCBI下載PRV的目標(biāo)基因TK、gE和VP16序列，輸入sgRNA網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/進(jìn)行sgRNA的目標(biāo)序列的設(shè)計(jì)，挑選合適的sgRNA由福州鉑尚生物公司合成(表1)。

表1 sgRNA引物

sgRNA合成后，加入PBS進(jìn)行混勻，置于梯度PCR儀中進(jìn)行退火，退火體系：Primer R 1 μL，Primer F 1 μL，10× PCR Buffer 2 μL，無(wú)菌水16 μL。退火反應(yīng)條件：95 ℃，10 min，然后按2 ℃·s-1的速度讓退火溫度下降至85 ℃，接著又以0.25 ℃·s-1的速度降至25 ℃，最后以25 ℃維持1 min完成退火。將退火完成的sgRNA置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.1.2 pX601質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：1 μL的pX601質(zhì)粒(Amp抗性)加入100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，42 ℃恒溫?zé)岽碳?0 s，冰浴2～3 min；再加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，置37 ℃ 250 r·min-1培養(yǎng)1 h；取出菌，按4 000 r·min-1離心5 min，棄801 μL上清，留100 μL進(jìn)行重懸，均勻涂布在Amp平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h；隔日挑選單一的菌落，進(jìn)行擴(kuò)增，然后再PCR檢測(cè)，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.1.3 pX601質(zhì)粒的提取、酶切、純化及連接:按照康為世紀(jì)生物科技有限公司無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用BbsⅠ限制性核酸內(nèi)切酶切pX601質(zhì)粒。酶切的反應(yīng)條件：37 ℃ 10 min，65 ℃ 10 min。反應(yīng)中各組分：Plasmid pX601 5 μg，10×Fast Digest buffer 5 μL，BbsⅠ 5 μL，去離子水40 μL。

用TaKaRa DNA frangment purification kit提取并純化酶切后的pX601質(zhì)粒。接著用T4連接酶連接純化、酶切的pX601質(zhì)粒和退火后的sgRNA，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)液中各組分：T4 DNA Ligase 1 μL，10×T4 DNA buffer 2.5 μL，Vector 50 ng，sgRNA 150 ng，去離子水 21.5 μL。連接時(shí)將混合液輕輕混勻，置于PCR儀中16 ℃，3 h最后65 ℃ 10 min。

1.2.1.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證:將重組質(zhì)料轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中增殖，然后挑選單克隆進(jìn)行增殖，然后應(yīng)用PCR及測(cè)序驗(yàn)證(引物見(jiàn)表2)。

表2 選定基因的驗(yàn)證引物

1.2.2 重組腺聯(lián)病毒載體的包裝

1.2.2.1 重組腺聯(lián)病毒載體的驗(yàn)證引物：根據(jù)pX601質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)引物RT-pX601，用于鑒定腺聯(lián)病毒的組裝，具體序列見(jiàn)表2驗(yàn)證引物。

1.2.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞和病毒的收集：將5×106·mL-1的 293A細(xì)胞均勻平鋪于15 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁且匯合度達(dá)70%～90%時(shí)，棄除舊培養(yǎng)液，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；取3個(gè)EP管，分別加入135 μL的1 g·mL-1的PEI試劑和15 μg AAV2/5質(zhì)粒、10 μg pHelper質(zhì)粒，再分別加入20 μg pXTK、pXgE和pXVP16質(zhì)粒，PEI和質(zhì)粒量的總量比為3∶1，混勻后室溫靜置15 min；將含有3種混合質(zhì)粒的PEI混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，并輕搖混勻；做好標(biāo)記，放入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h；12 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；24 h后收集細(xì)胞上清(含重組腺聯(lián)病毒)，做好標(biāo)記存貯于4 ℃冰箱備用，并在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；24 h后，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞連同培養(yǎng)基收集到45 mL離心管中，反復(fù)凍融，劇烈震蕩后3 000 r·min-1離心5 mim，取上清。

1.2.2.3 重組腺聯(lián)病毒的滴度測(cè)定：取10 μL濃縮后的AAV病毒液提取全基因組；以AAV病毒基因組和pX601質(zhì)粒作為模板，Q-Cas9為引物，進(jìn)行Real-time PCR；然后計(jì)算病毒拷貝數(shù)：首先計(jì)算出作為模板的0.15 ng pX601質(zhì)粒的摩爾數(shù)，計(jì)算公式“摩爾數(shù)=總質(zhì)量/分子量”[pX601是堿基數(shù)為7 447 bp的dsDNA平均分子量(MW)=(堿基數(shù))×(660道爾頓/堿基)=7 447×660道爾頓，即7 447×660 g·mol-1，pX601摩爾數(shù)=0.15×10-9/(7 447×660)mol；0.15 ng pX601質(zhì)粒的拷貝數(shù)=6.02×1023×0.15×10-9/(7 447×660)=1.84×107拷貝數(shù)]；然后根據(jù)real-time PCR結(jié)果，計(jì)算出3種重組腺聯(lián)病毒載體和pX601質(zhì)粒表達(dá)Cas9的倍數(shù)比，將倍數(shù)乘以0.15 ng pX601質(zhì)粒的拷貝數(shù)，得出AAV基因組的拷貝數(shù)；再根據(jù)模板AAV基因組占10 μL AAV的基因組的比值，計(jì)算出10 μL AAV的拷貝數(shù)。

1.2.2.4 重組腺聯(lián)病毒載體及功能驗(yàn)證：重組腺聯(lián)病毒感染5×105·mL-1的ST細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，按照TRIzol中的操作方法提取細(xì)胞總RNA，再應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，接著應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)重組腺聯(lián)病毒中的Cas9、TK基因、gE和VP16的mRNA水平。

1.2.2.5 攜帶Cas9-TK-gE-VP16的編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞：5×105·mL-1ST細(xì)胞均勻分布于6孔板中，細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)至匯合度80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，更換新鮮的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；取1EP管，按PEI和質(zhì)粒3∶1的質(zhì)量比，分別加入2.5 μg質(zhì)粒和1 g·mL-1的PEI 7.5 μL；將含有敲除質(zhì)粒的PEI混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，并輕輕搖晃混勻；做好標(biāo)記，置37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。

1.3 重組腺聯(lián)病毒系統(tǒng)在細(xì)胞水平對(duì)感染PRV的治療效果評(píng)估

1.3.1 重組腺聯(lián)病毒載體感染ST細(xì)胞 ST細(xì)胞以5×105·mL-1的濃度均勻鋪于6孔板中，等細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)至匯合度達(dá)80%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，更換新鮮的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；將攜帶3個(gè)不同片段的3種AAV(AAV-TK、AAV-gE、AAV-VP16)的稀釋，取部分AAV稀釋到109拷貝·mL-1；每種AAV濃度設(shè)置4個(gè)時(shí)間梯度，分別為感染ST細(xì)胞8、16、24、32 h(從加入PRV后開(kāi)始計(jì)時(shí))，每種AAV設(shè)置1個(gè)對(duì)照(只加AAV)，取108拷貝分別加入6孔板中混勻，并做好標(biāo)記，置37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后換液加入PRV。

1.3.2 ST細(xì)胞形態(tài)變化觀察和收集 每到一個(gè)時(shí)間梯度時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，做好標(biāo)記，再進(jìn)行細(xì)胞樣品收集和細(xì)胞總RNA的純化。

1.3.3 ST細(xì)胞中的PRV核酸拷貝數(shù)的變化情況 按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用Real-time PCR測(cè)定ST細(xì)胞中的PRV核酸拷貝數(shù)的變化情況，在MicroAmp?Fast 8-Tube Strip 0.1 mL 快速反應(yīng)8聯(lián)管中配制反應(yīng)混合液，反應(yīng)條件為95 ℃ 20 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s 結(jié)束。其中,95 ℃反應(yīng)20 s為第一階段(稱為Hold Stage),第二階段為PCR Stage(即95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s)；最后一步為熔解曲線擴(kuò)增階段(即95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s)。第二階段進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，退火溫度因不同基因而不同。每組做3個(gè)重復(fù)。根據(jù)Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

反應(yīng)體系設(shè)置為10 μL，各組分組成：前后引物各0.25 μL，模板 120 ng，SYBR? Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)ROX Plus 5 μL，DEPC水0.5 μL。

1.4 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)對(duì)感染PRV小鼠的治療效果評(píng)估

1.4.1 小鼠感染PRV半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定

1.4.1.1 Karber法計(jì)算PRV滴度：取10 μL病毒液進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度相差10倍體積，每個(gè)稀釋梯度為8個(gè)復(fù)孔。每隔24 h觀察細(xì)胞病變情況，連續(xù)觀察直至沒(méi)有新病變孔出現(xiàn)。然后統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性孔比例，根據(jù)公式lgTCID50=L-d(S-0.5)計(jì)算出PRV的滴度，L為最高稀釋度的對(duì)數(shù)，d為稀釋度對(duì)數(shù)之間的差，S為陽(yáng)性孔比例總和。lgLD50=Xk-d(∑p-0.5)，Xk為最大劑量對(duì)數(shù)，∑p為各劑量組死亡率之和，d為稀釋度對(duì)數(shù)之間的差。

1.4.1.2 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)：取30只BALB/c小鼠，分為6組,分別為1×106.5TCID50組、1×105.5TCID50組、1×104.5TCID50組、1×103.5TCID50組、1×102.5TCID50組及空白對(duì)照組?？瞻捉M注射DMEM，肌內(nèi)注射，注射部位均為左后腿肌肉，注射體積為100 μL。每天記錄小鼠的存活情況。

1.4.2 治療試驗(yàn)分組 取110只20 g左右的BALB/c小鼠，隨機(jī)平均分成兩大組：觀察組和試驗(yàn)組，觀察組用于觀察小鼠的生理狀況和死亡統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)組用于小鼠組織的采取。具體分組：100 μL DMEM+10 μL生理鹽水注射1次組，PRV注射1次組，AAV-TK注射治療1次組，AAV-gE注射治療1次組，AAV-VP16注射治療1次組，AAV-TK注射治療2次組，AAV-gE注射治療2次組，AAV-VP16注射治療2次組，AAV-TK注射治療3次組，AAV-gE注射治療3次組，AAV-VP16注射治療3次組，每組5只小鼠，共11組。其中PRV用肌內(nèi)注射法(注射小鼠后腿內(nèi)側(cè))，注射量為5×104TCID50，只注射1次；AAV用尾靜脈注射法,每次注射109拷貝數(shù)，分注射1次、2次和3次組，多次注射組為隔天注射，表中PRV+AAV的注射次數(shù)指的是AAV的注射次數(shù)；DMEM和生理鹽水分別用肌內(nèi)注射、尾靜脈注射。

1.4.3 小鼠生理狀態(tài)觀察 注射病毒后，每天記錄觀察組中各組小鼠的生理變化，包括小鼠的進(jìn)食、精神狀態(tài)、瘙癢癥傷口面積、死亡數(shù)量和時(shí)間、觀察是否有特殊病理行為，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.4 小鼠組織采取 在小鼠的腹腔注射250 μL的5%水合氯醛，麻醉小鼠，用200 mL的注射器裝滿DEPC水，連接4號(hào)半的輸液器針頭，在注射泵上固定；麻醉后解剖小鼠，剪開(kāi)小鼠胸腔露出心，剪破右心耳，將針頭刺入心尖3～4 mm開(kāi)始灌注，灌注約20 mL DEPC水時(shí)，灌注完成(直到小鼠耳部、趾部沒(méi)有血色)；取小鼠腦部及脾組織，并將其從小鼠身上剝離，將脾組織放入預(yù)備的做有相應(yīng)標(biāo)記EP管中，放入-80 ℃冰箱內(nèi)冰凍(用于總RNA的純化)。

1.4.5 小鼠腦部組織總RNA純化 取小鼠腦組織5 g，放入1.5 mL EP管中，加入200 μL的TRIzol，研磨成組織漿液，再加入800 μL TRIzol，進(jìn)行細(xì)胞總RNA的純化。

1.4.6 cDNA的合成 按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4.7 Real-time PCR 具體試驗(yàn)步驟參見(jiàn)cDNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

1.5 圖像分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)中測(cè)序結(jié)果用Mega 5.0和Bioedit軟件分析；RT-PCR結(jié)果用CorelDRAW軟件處理分析。

2 結(jié) 果

2.1 編輯質(zhì)粒的驗(yàn)證

將sgRNA連接到pX601質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序和生物學(xué)軟件Bioedit的比對(duì)證實(shí), 目標(biāo)序列的sgRNA成功構(gòu)建針對(duì)PRV 3個(gè)關(guān)鍵基因的pX601編輯質(zhì)粒(圖2)。

2.2 編輯質(zhì)粒的功能驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證編輯質(zhì)粒的靶基因序列，分別將pXTK、pXgE和pXVP16 3種編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞12 h，后加入1×105TCID50的PRV，24 h后收集含PRV的細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融3次，提PRV基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，PRV的病毒基因在靶基因位置出現(xiàn)了套疊峰，證實(shí)編輯質(zhì)粒在PRV的TK、gE和VP16位置發(fā)生了剪切編輯(詳細(xì)的編輯效率之前文章已經(jīng)驗(yàn)證)[17]，具備剪切PRV的功能(圖3)。

圖3 3種剪切質(zhì)粒對(duì)PRV剪切的測(cè)序驗(yàn)證

2.3 評(píng)估重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)在ST細(xì)胞模型中清除PRV

2.3.1 pT-IE180載體的構(gòu)建 pT-IE180載體是本研究構(gòu)建的含PRVIE180基因部分片段的TA克隆載體。用ExTaq酶擴(kuò)增出PRVIE180基因目的片段，連接到pMD19-T上，目的片段大小為101 bp，測(cè)序結(jié)果如圖4，可以看出質(zhì)粒載體上有約100 bp的序列與PRVIE180基因片段相同，圖中兩個(gè)不同的堿基是所用的PRV基因組參照系列的點(diǎn)突變。

圖4 PRV IE180基因組和T-IE180序列比對(duì)

2.3.2 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)對(duì)ST細(xì)胞中PRV拷貝數(shù)影響 ST細(xì)胞以5×105·mL-1的細(xì)胞濃度均勻鋪于6孔板中，在鋪板的同時(shí)分別加入1×108拷貝數(shù)的AAV-gE、AAV-TK和AAV-VP16，12 h后給細(xì)胞換液，并加入105TCID50的PRV處理細(xì)胞，在12、18、24 h 3個(gè)時(shí)間段收集細(xì)胞，并提取細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，用IE180和豬源管家基因GAPDH基因引物進(jìn)行Real-time PCR，檢測(cè)不同時(shí)段細(xì)胞中病毒量的變化情況。如圖5所示，在12 h不同AAV處理過(guò)的細(xì)胞中PRV量相比于沒(méi)有處理過(guò)的細(xì)胞并沒(méi)明顯的減少，而18 h時(shí)，AAV-gE和AAV-VP16處理組，PRV的IE180的拷貝數(shù)明顯下降(P≤0.01)，但AAV-TK、AAV-gE和AAV-VP16 3組間的變化卻不明顯。24 h時(shí)，AAV-TK、AAV-gE和AAV-VP16處理組的PRVIE180的拷貝數(shù)出現(xiàn)更為顯著的下降(P≤0.001)。

**.P≤0.05; ***.P≤0.001

2.3.3 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)降低了PRV對(duì)ST細(xì)胞致病性 ST細(xì)胞以5×105·mL-1的細(xì)胞濃度均勻鋪于6孔板中，在鋪板的同時(shí)分別加入1×108拷貝數(shù)的AAV-gE、AAV-TK和AAV-VP16，12 h后給細(xì)胞換液，并加入105TCID50的PRV處理細(xì)胞，每到一個(gè)時(shí)間梯度時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，做好標(biāo)記，記錄細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與沒(méi)有處理過(guò)的細(xì)胞相比，12 h時(shí)不同AAV相關(guān)治療系統(tǒng)處理過(guò)的細(xì)胞的拉網(wǎng)、聚集及死亡現(xiàn)象明顯較少，細(xì)胞的病變整體較為輕微。

如圖6所示，在24 h時(shí)可以觀察到大部分對(duì)照細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始病變(變圓)，且可以觀察到漂在培養(yǎng)液中的死細(xì)胞，在40 h時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁，細(xì)胞全部死亡，AAV-gE、AAV-TK和AAV-VP16接種組相對(duì)較好。

圖6 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)降低了PRV對(duì)ST細(xì)胞致病性

2.4 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)降低了PRV在小鼠體內(nèi)的增殖

2.4.1 小鼠感染PRV半數(shù)致死量的測(cè)定 觀察并記錄小鼠每天的存活情況，并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，如圖7，從圖中可以看出PRV對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為103.5TCID50。

圖7 PRV對(duì)小鼠的半數(shù)致死量分析

2.4.2 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)對(duì)感染PRV后小鼠“偽狂犬瘙癢癥”影響 豬的PRV宿主范圍較廣，可感染不同年齡的豬、牛、綿羊、犬、貓、水貂、雪貂、小鼠、大鼠和豚鼠等。在不同種屬間表現(xiàn)的臨床癥狀往往不一樣，哺乳小豬或斷奶小豬感染該病毒后常表現(xiàn)為腹瀉或部分有神經(jīng)癥狀。但小鼠感染該病毒則表現(xiàn)為明顯的瘙癢癥，尤其通過(guò)肌內(nèi)注射進(jìn)行感染試驗(yàn)時(shí)，小鼠的瘙癢癥明顯。為了評(píng)估AAV攜帶的CRISPR系統(tǒng)對(duì)PRV的治療效果，本研究中記錄AAV攜帶的CRISPR系統(tǒng)對(duì)PRV的治療中各組小鼠的瘙癢癥狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒后注射1次的AAV-gE治療組小鼠有2只出現(xiàn)輕微的瘙癢癥狀(撓后腿)(表3，圖8b)，而注射2次的則出現(xiàn)1只，注射3次的小鼠并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的搔癢癥(表3)。另外一組，AAV-VP16組，注射1、2、3次則分別出現(xiàn)3、2和1只(表3，圖8 d)。而AAV-TK治療組，出現(xiàn)搔癢癥小鼠較少，只在注射治療1次組出現(xiàn)1只搔癢癥小鼠(表3)，其他的小鼠則沒(méi)有明顯的搔癢癥表現(xiàn)。而對(duì)照組(未進(jìn)行治療)的小鼠全部出現(xiàn)搔癢癥(圖8a)。

表3 重組腺聯(lián)病毒治療對(duì)小鼠“偽狂犬瘙癢癥”發(fā)生的影響

a.未注射AAV;b.注射AAV 1次；c.注射AAV 2次；d.注射AAV 3次

2.4.3 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)降低了PRV對(duì)小鼠致病性 經(jīng)AAV-TK治療1次的PRV感染小鼠(圖9a)，100 h內(nèi)，死亡5只，死亡時(shí)間推后約2 d(平均死亡時(shí)間46 h)，且存活2只小鼠；經(jīng)AAV-TK治療2次的PRV感染小鼠則死亡4只，存活3只，且小鼠的死亡時(shí)間也是明顯推后(平均死亡時(shí)間82.5 h)；而治療3次的小鼠，則全部存活，在100 h的觀察時(shí)間內(nèi)存活率最高，而且存活時(shí)間最長(zhǎng)。AAV-VP16治療組中注射1次AAV-VP16的僅有1只存活，注射2次AAV-VP16有2只存活，注射3次AAV-VP16則有5只存活(圖9b)。通過(guò)AAV-gE治療發(fā)現(xiàn)，小鼠生存曲線如圖9c，從圖9c中可以看出AAV-gE注射2次的治療小鼠有2只小鼠存活，3次的則有6只存活，從圖9c中可以看出AAV-gE治療的小鼠存活狀況比不治療的小鼠情況略好些，在一定時(shí)間內(nèi)存活率略大些，存活時(shí)間也更久。從圖9中可以看出AAV-TK、AAV-VP16和AAV-gE組注射3次的小鼠存活率均超過(guò)70%，其中AAV-TK組達(dá)到100%的存活(100 h)，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明3次注射效果比1次和2次都好，且以AAV-TK組小鼠療效最好。只進(jìn)行AAV尾靜脈注射和注射DMEM與生理鹽水的小鼠全部存活，且很有活力，生理體征都正常。

a.AAV-TK; b.AAV-VP16; c.AAV-gE

2.4.4 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)對(duì)PRV感染小鼠的免疫器官的影響 AAV本身是DNA病毒，作為外源核酸病原體常引起小鼠的免疫應(yīng)答作用，從而導(dǎo)致小鼠免疫器官的變化。為了評(píng)估重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)是否對(duì)機(jī)體的免疫有上調(diào)作用，對(duì)注射不同次數(shù)腺病毒攜帶編輯質(zhì)粒的小鼠進(jìn)行麻醉，再用DEPC水對(duì)小鼠進(jìn)行灌注，然后再取脾，拍照并測(cè)量比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射PRV的小鼠脾組織比只注射DMEM和生理鹽水的正常小鼠小，而只注射AAV的小鼠脾組織有些腫大。圖10a～c為相同注射次數(shù)的3種AAV治療小鼠脾組織的對(duì)比，可以看出用AAV-TK治療3次小鼠的脾大小和形狀最接近正常小鼠，而用AAV-gE和AAV-VP16治療的小鼠脾都有一定程度的萎縮，但是比單純注射PRV的小鼠好些，可見(jiàn)3種AAV對(duì)治療感染PRV的小鼠都有一定的療效，其中AAV-TK的治療效果最佳。圖10a～c分別為相同AAV不同注射次數(shù)的小鼠脾進(jìn)行對(duì)比，從圖中可以看出，AAV-TK和AAV-gE注射2次時(shí)小鼠的脾大小和形狀最接近正常小鼠，而AAV-VP16注射3次時(shí)小鼠脾最接近正常小鼠(圖10c)。

a.注射AAV 1次；b.注射AAV 2次；c.注射AAV 3次

2.4.5 重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)部分抑制PRV在小鼠腦組織中的復(fù)制 PRV是一種嗜神經(jīng)病毒，感染后在腦部組織的分布較高，可作為發(fā)病的指征。此外，小鼠感染PRV后，常表現(xiàn)為典型搔癢癥，因而本研究通過(guò)檢測(cè)小鼠的腦部組織病毒的載量，來(lái)初步評(píng)估重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)對(duì)PRV感染小鼠治療效果。用IE180引物和小鼠腦組織cDNA進(jìn)行Real-time PCR。結(jié)果如圖11，經(jīng)過(guò)重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)治療的小鼠，腦組織中病毒的拷貝數(shù)都比對(duì)照組低(P≤0.01)。經(jīng)過(guò)重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)治療的小鼠2次和3次的小鼠腦組織的病毒的拷貝數(shù)顯著比對(duì)照組低(P≤0.001)。此外，AAV-TK注射3次的治療組腦部組PRV量比AAV-gE組還低(P≤0.05)。這個(gè)結(jié)果表明重組腺聯(lián)病毒編輯系統(tǒng)對(duì)小鼠腦部PRV的載量有下調(diào)作用，而AAV-TK組的降低效果最為明顯。

*.P≤0.05; P≤0.01; ***.P≤0.001

3 討 論

PRV感染在我國(guó)生豬養(yǎng)殖中較為普遍，且對(duì)生產(chǎn)影響較大。若要凈化PRV陽(yáng)性豬群，只能通過(guò)嚴(yán)格篩查并及時(shí)淘汰[18-21]。但該方法操作繁瑣，代價(jià)高，并不適合當(dāng)前生豬養(yǎng)殖。因而對(duì)于感染PRV的陽(yáng)性豬及陽(yáng)性豬場(chǎng)，采取有效的治療手段是當(dāng)前降低生豬養(yǎng)殖虧損，促進(jìn)生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。本試驗(yàn)中作者通過(guò)重組腺聯(lián)病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，進(jìn)入PRV感染小鼠體內(nèi)，剪切PRV的毒力基因TK和gE，以及復(fù)制相關(guān)基因VP16，以期減弱PRV的毒力和復(fù)制能力，乃至清除小鼠體內(nèi)的病毒。據(jù)報(bào)道，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅對(duì)動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌和病毒能進(jìn)行實(shí)時(shí)靶向編輯，而且能夠用于動(dòng)物和部分人的胚胎基因編輯。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還成功地治療亨廷頓氏病(huntingtin基因突變引起的疾病)的小鼠，矯正了嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病[11-12]。本試驗(yàn)中作者利用重組腺聯(lián)病毒載體來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，明顯地減少了細(xì)胞和小鼠組織中PRVIE180的mRNA，抑制了PRV的復(fù)制和進(jìn)一步的繁殖。隨著冶療次數(shù)增加，細(xì)胞病變減少。小鼠典型“偽狂犬搔癢癥”明顯減輕，一定時(shí)間小鼠的存活時(shí)間和存活率都獲得提高，這個(gè)結(jié)果與預(yù)期一致。

本研究應(yīng)用偽狂犬病病毒IE180基因作為評(píng)估重組腺聯(lián)病毒載體編輯系統(tǒng)的治療效果，主要是因?yàn)橹坝醒芯繄?bào)道，偽狂犬病病毒只含一個(gè)立即早期基因，即IE180基因，該基因?qū)Σ《驹趧?dòng)物體內(nèi)的復(fù)制至關(guān)重要[22]，只有IE180基因開(kāi)放轉(zhuǎn)錄，并翻譯成IE180蛋白,其下游的基因才能在IE180蛋白的激活作用下得以完全開(kāi)放轉(zhuǎn)錄,否則病毒復(fù)制將不能完成。IE180基因的表達(dá)產(chǎn)物IE180蛋白是一個(gè)多功能蛋白，不僅能激活同源蛋白基因啟動(dòng)子，而且能激活某些異源蛋白基因啟動(dòng)子[23-26]。細(xì)胞試驗(yàn)表明，IE180拷貝數(shù)低的處理組，其細(xì)胞的病變也較輕；通過(guò)評(píng)價(jià)感染PRV小鼠和治療組小鼠的存活率、存活時(shí)間以及體征，作者發(fā)現(xiàn)PRV的IE180較低組，其小鼠成活率較高，死亡率較低，小鼠出現(xiàn)搔癢癥的現(xiàn)象也明顯減少；防治效果和治療的次數(shù)成正比。這進(jìn)一步證實(shí)，該小鼠模型的結(jié)果對(duì)當(dāng)前陽(yáng)性PRV豬的治療有一定的借鑒作用。

研究中還發(fā)現(xiàn)，雖然運(yùn)載有三種重組CRISPR/Cas-sgRNA表達(dá)系統(tǒng)的AAV由于自身具有免疫原性，在一定程度上引起了小鼠機(jī)體內(nèi)的免疫反應(yīng)，但對(duì)小鼠并沒(méi)有致病性傷害，且對(duì)PRV感染小鼠有一定的治療效果。其中，AAV-TK和AAV-VP16治療組小鼠注射2次時(shí)的治療效果最好，AAV-gE治療組小鼠的治療效果較差。作者還對(duì)比了不同AAV注射不同次數(shù)治療小鼠的脾組織，發(fā)現(xiàn)PRV感染小鼠的脾出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，而經(jīng)過(guò)AAV治療后的小鼠脾組織萎縮有明顯改善。

應(yīng)用重組腺聯(lián)病毒載體運(yùn)載CRISPR/Cas9系統(tǒng)治療PRV感染是可行的。AAV-TK和AAV-gE減弱PRV毒性，而AAV-VP16抑制PRV的復(fù)制，3種AAV治療PRV感染都有一定的效果。在3種AAV的治療結(jié)果中，注射3次AAV的治療比注射1和2次的效果好。由于小鼠試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)有限，體內(nèi)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)尚且不明確，有可能和豬體內(nèi)的效果不完全一致，因此該方法在豬的治療效果尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

重組腺聯(lián)病毒載體編輯系統(tǒng)用于感染PRV的ST細(xì)胞，能明顯減緩和減輕ST細(xì)胞病變；用于PRV感染小鼠，可降低感染小鼠的死亡率、延長(zhǎng)存活時(shí)間，提高成活率，減輕搔癢癥，治療效果和治療次數(shù)成正比。