許 寫，石東風(fēng)，吳嘉韻，吳圣龍,2，王海飛,2，吳正常,2*，包文斌,2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

m6A廣泛存在于各種真核生物mRNA和非編碼RNA中，m6A修飾可以功能性地調(diào)節(jié)真核生物的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從mRNA在細(xì)胞核中的加工到在細(xì)胞質(zhì)的翻譯和降解，m6A幾乎影響到了動(dòng)物mRNA代謝的每個(gè)階段[1-2]。此外，m6A參與了多種生物學(xué)過程，如干細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、配子發(fā)生和生物節(jié)律等，以及多種疾病的發(fā)生，包括腫瘤、肥胖和不育等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化修飾在病毒復(fù)制周期中扮演不同角色，在病毒的侵染復(fù)制過程中具有重要調(diào)控作用[4]，同時(shí)m6A在免疫系統(tǒng)及其在宿主病原體相互作用中也發(fā)揮作用[5]。相比于人和小鼠，畜禽m6A對(duì)重要性狀的調(diào)控作用及其機(jī)制研究還不夠深入，關(guān)于豬m6A甲基化修飾的研究主要集中在脂肪沉積[6-7]、脂質(zhì)代謝[8]、卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育[9]、多功能干細(xì)胞分化[10]和肝發(fā)育[11]等方面，由此表明，m6A甲基化修飾正在成為目前畜禽遺傳領(lǐng)域RNA表觀遺傳學(xué)研究的一個(gè)新方向。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素，是鐮刀菌的代謝產(chǎn)物之一，是目前農(nóng)產(chǎn)品及飼料中污染率和超標(biāo)率最高的一種霉菌毒素[12-13]。DON易于在人和動(dòng)物體內(nèi)傳播，主要改變腸道營養(yǎng)吸收、屏障功能和免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)腸道病變[14-15]。腸道是豬機(jī)體抵御嘔吐毒素侵害的第一道屏障，霉菌毒素可以直接通過激活細(xì)胞信號(hào)通路影響腸道黏蛋白的表達(dá)，還可以破壞黏液層及緊密連接，有利于病原菌等有害物質(zhì)入侵，激活細(xì)胞信號(hào)通路或間接影響細(xì)胞因子的水平[16]。在涉及到豬腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)的研究中表明，當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞受到DON的誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終會(huì)加速細(xì)胞的凋亡并使其功能受損[17-18]。然而，迄今為止關(guān)于DON誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞中的m6A發(fā)生變化的研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，METTL3介導(dǎo)m6A修飾在免疫細(xì)胞的分化和功能分工上扮演著非常重要的角色，敲除METTL3基因會(huì)抑制CD4+T細(xì)胞分化，進(jìn)而引起小鼠腸炎[19]；METTL3通過激活NF-κВ信號(hào)通路促進(jìn)LPS刺激的巨噬細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)[20]。

本研究在課題組前期構(gòu)建的嘔吐毒素感染豬小腸上皮(IPEC-J2)細(xì)胞研究模型(終濃度為1 μg·mL-1，作用時(shí)間48 h)基礎(chǔ)上，探究豬m6A甲基化酶METTL3基因表達(dá)水平變化與DON誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞損傷的相關(guān)性，以期為今后開展METTL3基因功能及其在抵抗DON損傷的育種工作中應(yīng)用提供參考依據(jù)，為今后細(xì)致研究RNA甲基化修飾在仔豬抵抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇損害調(diào)控中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品及材料

豬腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)由本實(shí)驗(yàn)室保存；人腎上皮細(xì)胞系293T購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；動(dòng)物RNA抽提試劑盒(離心柱式)及細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒及細(xì)胞增殖檢測試劑均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及活性氧檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3基因干擾siRNA及慢病毒均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.2 豬腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2及人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞培養(yǎng)

將IPEC-J2細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞以1×106個(gè)·孔-1的密度接種于6孔板內(nèi)；使用DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(10 kU·mL-1青霉素、10 mg·mL-1鏈霉素)組成的完全培養(yǎng)液，將細(xì)胞放置在恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，50 mL·L-1CO2)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 siRNA瞬轉(zhuǎn)及干擾效率鑒定

IPEC-J2以5×104個(gè)·孔-1的密度接種到12孔板中，待融合度達(dá)到60%左右進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。每孔的轉(zhuǎn)染體系：向100 μL jetPRIME Buffer加入2 μL siRNA和3 μL jetPRIME reagent，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min。將轉(zhuǎn)染混合物加入孔中，每組3個(gè)重復(fù)。24 h后提取細(xì)胞RNA檢測METTL3 mRNA表達(dá)。

1.4 慢病毒包裝干擾載體

293T細(xì)胞接種到15 cm培養(yǎng)皿中至細(xì)胞融合度60%左右，挑選上述干擾效率最高的siRNA序列，利用Gateway重組技術(shù)將干擾載體克隆到慢病毒載體上。將重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞上清液，4 ℃ 4 000 r·min-1離心5 min后過濾上清，4 ℃ 20 000 r·min-1離心2 h濃縮病毒液。

1.5 慢病毒滴度檢測

293T細(xì)胞以3×104個(gè)·孔-1的密度接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。用DMEM完全培養(yǎng)基將10 μL慢病毒原液10倍稀釋4個(gè)梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)，再將100 μL稀釋液和0.5 μg Polybrene加入96孔板的孔中，每組3個(gè)重復(fù)。孵育24 h后更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。通過FACS計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.6 慢病毒侵染IPEC-J2細(xì)胞及干擾效果鑒定

IPEC-J2以5×104個(gè)·孔-1的密度接種到12孔板中，待融合度達(dá)到60%左右進(jìn)行慢病毒侵染。加入5 μL 1×108TU·mL-1的慢病毒和5 μg Polybrene，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，混勻后孵育48 h。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，每孔加入5 μg嘌呤篩選陽性細(xì)胞，直至無熒光細(xì)胞全部死亡。將陽性細(xì)胞消化傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)。收集細(xì)胞提取RNA和蛋白，檢測METTL3表達(dá)情況。

1.7 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI(http://www.NCBI.Nlm.nih.govn/)數(shù)據(jù)庫中豬TNF-α、Bax、Caspase3、Caspase9、GPXs、CAT、Mn-SOD、CuZn-SOD、IL-6、IL-12、β-actin等基因序列，為防止基因組DNA污染，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)跨外顯子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，引物均由擎科生物科技(北京)有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物

1.8 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

利用動(dòng)物RNA抽提試劑盒(離心柱式)對(duì)處理過的每孔細(xì)胞的RNA進(jìn)行抽提，并利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳及利用NanoDrop 1000 核酸/蛋白濃度測定儀對(duì)抽提的RNA進(jìn)行濃度和純度測定后，在達(dá)到所規(guī)定要求后(A260/A280的比值在1.7～2.1之間)-80 ℃保存，將每個(gè)抽提出的RNA作為模板按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：5×qRT SuperMix II 2 μL，模板RNA 500 ng，RNase-free ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板cDNA 2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL,2×Ace TM qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增熔解曲線并分析，熔解曲線程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.9 細(xì)胞活力測定

收集轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細(xì)胞(METTL3干擾組和對(duì)照組)，以500個(gè)·μL-1的細(xì)胞密度接種200 μL含有DON的細(xì)胞液于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后按照CCK8操作說明書進(jìn)行操作，每孔加入10 μL CCK8溶液，然后37 ℃培養(yǎng)2 h，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(A)值。

1.10 細(xì)胞周期檢測

待六孔板中轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細(xì)胞(METTL3干擾組和對(duì)照組各3個(gè)重復(fù))密度達(dá)到80%，加入含DON的DMEM完全培養(yǎng)液避光放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h后按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集到離心管中備用，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用1 mL預(yù)冷70%乙醇吹打混勻放置4 ℃過夜固定。1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞再次離心棄上清。每管加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分懸浮細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。使用標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，計(jì)數(shù)1萬個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用FlowJo 10.0分析細(xì)胞周期。

1.11 細(xì)胞凋亡檢測

待六孔板中轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細(xì)胞(METTL3干擾組和對(duì)照組各3個(gè)重復(fù))密度達(dá)到80%，加入含DON的DMEM完全培養(yǎng)液避光放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h后按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集到離心管中備用，300×g離心10 min后棄上清。用1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，300 r·min-1離心10 min后棄上清。用1 mL Binding Buffer重懸細(xì)胞，300 r·min-1離心10 min后棄上清。用100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min。加入5 μL PI室溫避光孵育5 min，加入400 μL PBS輕吹混勻后按標(biāo)準(zhǔn)程序使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，計(jì)數(shù)1萬個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用CytExpert分析細(xì)胞凋亡。

1.12 活性氧(ROS)檢測

待六孔板中轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細(xì)胞(METTL3干擾組和對(duì)照組各3個(gè)重復(fù))密度達(dá)到80%，加入含DON的DMEM完全培養(yǎng)液避光放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h后按照試劑盒說明書進(jìn)行試劑制備和ROS檢測。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，使用含DCFH-DA的DMEM培養(yǎng)液(DCFH-DA∶DMEM培養(yǎng)液為1∶1 000)終止消化并收集到離心管中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻。用1 mL DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次以300 r·min-1離心10 min后棄上清。最后用500 μL PBS重懸細(xì)胞后按標(biāo)準(zhǔn)程序使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，計(jì)數(shù)1萬個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用CytExpert分析ROS。

1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，使用2-ΔΔCt對(duì)相關(guān)基因在細(xì)胞水平的實(shí)際表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，用單因素方差分析及T-TEST計(jì)算差異是否達(dá)到顯著水平，分別以P<0.05、P<0.01作為差異顯著與極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用Flow J 10.0 分析細(xì)胞周期結(jié)果，CytExpert分析細(xì)胞凋亡及活性氧水平結(jié)果，使用Excel軟件記錄細(xì)胞凋亡數(shù)目及ROS水平，用T-TEST判斷顯著性。柱狀圖統(tǒng)一使用Graphpad prism 8.0.2軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 METTL3基因穩(wěn)定干擾IPEC-J2細(xì)胞系的建立

通過設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞，通過qPCR檢測METTL3的轉(zhuǎn)錄水平。如圖1所示，siRNA-2的干擾效率最高，為62.5%，METTL3的表達(dá)極顯著下調(diào)(P<0.01)。因此選擇siRNA-2用慢病毒包裝。將重組干擾慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，說明慢病毒包裝成功，收集濃縮病毒液并進(jìn)行滴度測定。如圖2所示，分別加入稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍的病毒濃縮液，均可觀察到表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，且熒光細(xì)胞數(shù)量隨著稀釋倍數(shù)的增加而梯度減少。根據(jù)稀釋10-4倍病毒濃縮液處理孔中觀察到的熒光細(xì)胞計(jì)算病毒滴度為2×108TU·mL-1，滿足侵染細(xì)胞的濃度要求。慢病毒侵染IPEC-J2細(xì)胞，加入嘌呤藥篩獲得表達(dá)綠色熒光的shMETTL3及對(duì)照組細(xì)胞。通過qPCR和Western blot試驗(yàn)檢測細(xì)胞METTL3的mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)METTL3的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均極顯著低于陰性對(duì)照組，結(jié)果表明,METTL3穩(wěn)定干擾IPEC-J2細(xì)胞系構(gòu)建成功(圖3)。

METTL3干擾組與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P< 0.01)，下同

A.豬腸上皮細(xì)胞METTL3干擾細(xì)胞系中METTL3基因的mRNA水平檢測；B 豬腸上皮細(xì)胞METTL3干擾細(xì)胞系中METTL3的蛋白水平檢測

2.2 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對(duì)照組IPEC-J2細(xì)胞后相關(guān)基因的表達(dá)水平

為了確定細(xì)胞水平DON誘導(dǎo)后，METLL3表達(dá)量與細(xì)胞凋亡、免疫和氧化酶指標(biāo)的關(guān)系，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)DON誘導(dǎo)處理之后的METTL3基因干擾組和對(duì)照組的IPEC-J2細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因及氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因基因進(jìn)行表達(dá)水平檢測。結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)的基因Bax和Caspase9在METTL3基因干擾組IPEC-J2細(xì)胞的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，Caspase3在METTL3基因干擾組IPEC-J2細(xì)胞中的表達(dá)水平則極顯著低于對(duì)照組(P<0.01，圖4A)；如圖4B所示，干擾組細(xì)胞中TNF-α表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組，而IL-6、IL-12的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；如圖4C所示，氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因CAT、GPXs、CuZn-SOD干擾組的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對(duì)照組IPEC-J2細(xì)胞后細(xì)胞增殖的差異分析

為分析細(xì)胞水平上DON誘導(dǎo)后METTL3干擾組與對(duì)照組細(xì)胞增殖活性的差異程度，在豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞中干擾METTL3并經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h，利用CCK8增殖試驗(yàn)檢測處理之后IPEC-J2細(xì)胞的增殖活性，IPEC-J2細(xì)胞METTL3干擾組在450 nm處的光吸收值極顯著高于對(duì)照組(圖5)。這說明經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h之后，相比較對(duì)照組，干擾METTL3能極顯著的增強(qiáng)IPEC-J2細(xì)胞的增殖活性(P<0.01)。

圖5 DON誘導(dǎo)48 h METTL3干擾組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖活性變化

2.4 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對(duì)照組IPEC-J2細(xì)胞后細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的差異分析

為分析細(xì)胞水平上DON誘導(dǎo)后METTL3干擾組與對(duì)照組細(xì)胞周期和凋亡的變化程度，在豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞中干擾METTL3，DON誘導(dǎo)48 h，使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡檢測，結(jié)果如圖6A所示，對(duì)照組IPEC-J2細(xì)胞在4N時(shí)期的細(xì)胞百分比為15.5%，如圖6B所示METTL3干擾組IPEC-J2細(xì)胞在4N時(shí)期的細(xì)胞百分比為17.4%，在4N時(shí)期的細(xì)胞百分比數(shù)METTL3干擾組比對(duì)照組多1.9%，這表明經(jīng)DON誘導(dǎo)48 h后METTL3干擾組的細(xì)胞更多處于增殖狀態(tài)；由圖7A、B可知，METTL3干擾組細(xì)胞的晚凋細(xì)胞百分比為4.35%，早凋細(xì)胞百分比為3.25%，對(duì)照組細(xì)胞的晚凋細(xì)胞百分比為7.92%，早凋細(xì)胞百分比為3.99%，將細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)匯總并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由圖7C可知，干擾組的細(xì)胞凋亡總數(shù)顯著少于對(duì)照組，由此顯示METTL3干擾組IPEC-J2細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.05)。

A.豬腸上皮細(xì)胞對(duì)照組；B.豬腸上皮細(xì)胞METTL3干擾組

A.豬腸上皮細(xì)胞對(duì)照組；B.豬腸上皮細(xì)胞METTL3干擾組；C.細(xì)胞總凋亡數(shù)

2.5 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對(duì)照組IPEC-J2細(xì)胞后活性氧(ROS)的差異變化分析

為確定細(xì)胞水平上DON誘導(dǎo)METTL3干擾組與對(duì)照組IPEC-J2細(xì)胞的活性氧(ROS)變化程度，在豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞中干擾METTL3并經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h后，使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行活性氧水平檢測，并將ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)匯總并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖8 所示，METTL3干擾組細(xì)胞的活性氧相對(duì)熒光強(qiáng)度極顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.01)，活性氧相對(duì)熒光強(qiáng)度越高表示細(xì)胞受損傷程度越高，這表明METTL3干擾組細(xì)胞能一定程度抵抗由DON誘導(dǎo)而引起的細(xì)胞損傷。

A.鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白-異硫氰酸熒光素通道下的不同ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度細(xì)胞統(tǒng)計(jì)；B.對(duì)照組和METTL3干擾組的ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)比

3 討 論

在高等生物mRNA中，m6A是最豐富、最常見的轉(zhuǎn)錄修飾方式[21]。m6A修飾由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行修飾，去甲基化酶對(duì)修飾進(jìn)行消除，這一系列過程通過m6A結(jié)合蛋白進(jìn)行讀取和識(shí)別。m6A修飾也參與多種生物學(xué)功能調(diào)控，其在干細(xì)胞發(fā)生、機(jī)體發(fā)育、癌癥等多種生命進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[22-24]。催化m6A修飾的甲基化轉(zhuǎn)移酶在機(jī)體內(nèi)部以復(fù)合物形式存在并發(fā)揮作用，并且分工協(xié)作地對(duì)mRNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾的過程進(jìn)行催化。同時(shí)，m6A甲基化修飾過程是可逆的，這表明去甲基化酶在其中發(fā)揮著同樣重要的功效，其擁有去除mRNA上甲基化的功能，以此參與促進(jìn)m6A修飾mRNA的剪切、翻譯和降解等過程[25]。相關(guān)研究表明[26]，m6A甲基化修飾與機(jī)體腫瘤發(fā)生的過程密不可分。METTL3在乳腺癌組織的表達(dá)水平存在下降的變化，這說明m6A甲基轉(zhuǎn)移酶可能在一定程度上提高了乳腺癌發(fā)生的概率。除此之外，多個(gè)研究結(jié)果說明METTL3可以影響細(xì)胞發(fā)育、分化、炎癥等[27-28]。METTL3的缺失會(huì)顯著影響斑馬魚的生育能力并產(chǎn)生多種發(fā)育缺陷[29-30]，METTL3可通過調(diào)節(jié)MyD88的剪接來阻礙脂多糖(LPS)誘導(dǎo)而引發(fā)的炎癥反應(yīng)。可見METTL3甲基化酶在m6A甲基化修飾的過程中極其重要。本試驗(yàn)初步探討了豬METTL3基因在脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞中可能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。

本試驗(yàn)在豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)中對(duì)METTL3進(jìn)行干擾，經(jīng)DON誘導(dǎo)48 h后，對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因及氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DON誘導(dǎo)48 h后IPEC-J2細(xì)胞中的METTL3干擾組免疫因子TNF-α表達(dá)量相較對(duì)照組出現(xiàn)極顯著升高，IL-6、IL-12和Bax表達(dá)量相較對(duì)照組均出現(xiàn)顯著或極顯著下降，TNF-α是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物且其可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，在炎癥反應(yīng)中起到非常重要的調(diào)控和指示作用[31]，IL-6、IL-12和Bax為促細(xì)胞炎癥反應(yīng)基因，其可以反映細(xì)胞受到侵害產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的狀況，這表明在細(xì)胞受到DON的損傷之后會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)，METTL3干擾組細(xì)胞中可以一定程度上緩解因?yàn)镈ON誘導(dǎo)細(xì)胞而引起的炎癥反應(yīng)。METTL3干擾組的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中Caspase3和Caspase9兩個(gè)基因出現(xiàn)了顯著或極顯著的下降，這表明DON誘導(dǎo)48 h之后，將METTL3基因干擾后能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，使其表達(dá)量呈顯著或極顯著下降。研究表明，DON可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，影響抗氧化系統(tǒng)，從而一定程度上損傷細(xì)胞，使抗氧化酶基因mRNA的表達(dá)量降低[32]。谷胱甘肽(GSH)是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的小分子活性寡肽，谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)包括GSH及相關(guān)代謝酶,這形成生物體內(nèi)最重要的抗氧化防御系統(tǒng),其可以保護(hù)細(xì)胞免受ROS的攻擊[33]。脊椎動(dòng)物則一般含有CuZn-SOD和Mn-SOD，其是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，可以一定程度上反映機(jī)體清除氧自由基的能力[34]。過氧化氫酶(CAT)能夠預(yù)防過量的過氧化氫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用，并與超氧化物歧化酶協(xié)同作用抵抗機(jī)體受有害自由基的侵害[35-36]。METTL3干擾組的氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因中CAT、GPXs和CuZn-SOD的表達(dá)相比對(duì)照組均出現(xiàn)顯著上升，這表明降低METTL3基因的表達(dá)會(huì)通過某些途徑參與調(diào)控，進(jìn)而減弱因DON誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞而導(dǎo)致的抗氧化酶基因表達(dá)量下降的問題，在一定程度上幫助細(xì)胞進(jìn)行抗氧化過程從而抵抗DON誘導(dǎo)的損害。

為了更直觀地反映METTL3基因表達(dá)變化與DON誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞的關(guān)系及細(xì)胞的變化，本研究進(jìn)行了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及活性氧的檢測。結(jié)果表明，使用DON對(duì)METTL3基因干擾組和對(duì)照組IPEC-J2細(xì)胞誘導(dǎo)48 h后，METTL3干擾組的細(xì)胞增殖活性極顯著高于對(duì)照組，這說明干擾METTL3基因表達(dá)之后，極顯著緩解了細(xì)胞因DON誘導(dǎo)所致增殖活性下降。王琴等[37]研究表明，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶抑制劑p21表達(dá)升高,抑制SW480細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期,則會(huì)抑制細(xì)胞增殖，可以通過細(xì)胞周期檢測以反映細(xì)胞增殖的情況，而在METTL3干擾組處于S期和4N期的細(xì)胞百分比占比更高，這表明METTL3干擾組的IPEC-J2細(xì)胞相較對(duì)照組具有更多處于分裂或增殖階段的細(xì)胞[38]。相關(guān)研究表明，DON誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞之后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡出現(xiàn)上升的現(xiàn)象，本研究的細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，METTL3干擾組的細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著低于對(duì)照組，這表明將METTL3干擾之后，會(huì)顯著降低細(xì)胞因DON誘導(dǎo)而致細(xì)胞凋亡數(shù)量上升的現(xiàn)象。研究表明，DON可以誘導(dǎo)ROS的積累，增加脂質(zhì)過氧化程度，改變細(xì)胞膜和抗氧化系統(tǒng)的完整性[32]，活性氧(ROS)包括羥基自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫和脂質(zhì)過氧化的不穩(wěn)定中間體[39]，ROS的生成增加和細(xì)胞抗氧化能力下降是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的主要原因,并作為信號(hào)源干預(yù)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，影響細(xì)胞的數(shù)量[40-41]。本研究活性氧檢測結(jié)果說明，METTL3干擾組細(xì)胞的活性氧水平更低，因此推測，干擾METTL3基因的表達(dá)可以減弱細(xì)胞因受DON誘導(dǎo)產(chǎn)生過多ROS受損傷的程度。

本研究從細(xì)胞水平驗(yàn)證了METTL3對(duì)嘔吐毒素誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞損傷的作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在豬小腸上皮細(xì)胞中降低METTL3基因表達(dá)后，能一定程度幫助細(xì)胞抵抗因DON誘導(dǎo)所致細(xì)胞凋亡和炎癥損傷，今后需要進(jìn)一步利用m6A測序(MeRIP-seq)和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)來深入探究METTL3介導(dǎo)m6A修飾對(duì)DON誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的分子調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了METTL3基因穩(wěn)定干擾IPEC-J2細(xì)胞系，并經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及活性氧試驗(yàn)檢測表明，在IPEC-J2細(xì)胞中降低METTL3基因表達(dá)后，能一定程度幫助豬小腸上皮細(xì)胞抵抗因DON誘導(dǎo)所致的細(xì)胞凋亡和炎癥。METTL3表達(dá)下調(diào)有利于緩解DON對(duì)細(xì)胞損傷產(chǎn)生的一系列炎癥反應(yīng)。