梁冬牛，鄭磊，李娟（.山東省立第三醫(yī)院藥學(xué)部，濟(jì)南 25003；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，濟(jì)南 250033）

三拗片是麻黃、苦杏仁、甘草和生姜組成的中成藥制劑，具有宣肺解表的功效，用于風(fēng)寒襲肺證。其中麻黃具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的作用，而鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿是麻黃的主要功效成分；苦杏仁具有降氣止咳平喘、潤(rùn)腸通便的作用，其中主要成分為苦杏仁苷；甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用，其中主要功效成分甘草苷和甘草酸具有抗病毒和保護(hù)肺組織纖維化作用。三拗片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部，分別采用兩種不同的色譜條件檢測(cè)麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿以及苦杏仁中苦杏仁苷的含量以控制組方中麻黃和苦杏仁的質(zhì)量，增加了檢測(cè)的復(fù)雜性。目前已發(fā)表的文獻(xiàn)均是以?xún)煞N成分作為指標(biāo)成分控制該制劑的質(zhì)量，本文以三拗片組方中麻黃、苦杏仁和甘草作為研究對(duì)象，建立高效液相色譜波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定其中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷和甘草酸5 種指標(biāo)成分的含量，以有效控制其質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，日本島津公司），METELER XP205 電子分析天平（精度：0.01 mg，梅特勒公司），KQ-600DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q 超純水機(jī)（密理博公司）。

1.2 試藥

鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201809， 純度：100.0%）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)：171237-201510，純度：99.8%）、苦杏仁苷（批號(hào)：110820-201808，純度：88.2%）、甘草苷（批號(hào)：111610-201908，純度：95.0%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-202021，純度：96.2%，甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量/1.0207）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院），三拗片（規(guī)格：0.5 g/片，批號(hào)：2003065、2001025、1903063、1905033、1912075、1910013，濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司），乙腈（色譜純，Merck公司），磷酸（優(yōu)級(jí)純），超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Capcell pak C（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速為1.0 mL·min；檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm（鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷），237 nm（甘草苷和甘草酸）；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～8 min，5%A；8 ～13 min，5% ～10%A；13 ～18 min，10% ～20%A；18 ～30 min，20%～50%A）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取本品20 片，除去薄膜衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，精密稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再精密稱(chēng)定，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取鹽酸麻黃堿對(duì)照品16.36 mg，鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品12.09 mg，苦杏仁苷對(duì)照品97.61 mg，甘草苷對(duì)照品13.73 mg，甘草酸銨對(duì)照品26.94 mg，分別置10 mL 量瓶中，用70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度分別為鹽酸麻黃堿1.636 mg·mL，鹽酸偽麻黃堿1.207 mg·mL，苦杏仁苷8.609 mg·mL，甘草苷1.304 mg·mL，甘草酸2.539 mg·mL。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置同一100 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照《中國(guó)藥典》2020年版一部中三拗片處方及制法，分別制備不含麻黃、苦杏仁、甘草的陰性樣品，再按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備不含麻黃、苦杏仁、甘草的陰性樣品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下空白溶劑（70%甲醇溶液）、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與各陰性樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果5 種待測(cè)成分色譜峰峰形良好，且與相鄰色譜峰之間的分離度均符合要求，陰性樣品溶液無(wú)干擾。同時(shí)采用高效液相色譜儀二極管陣列檢測(cè)器對(duì)5 種待測(cè)成分色譜峰光學(xué)純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為單一成分的色譜峰。

圖1 三拗片高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of San’ao tablet

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置100 mL 量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制得5 種待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以各對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（

X

，μg·mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（

Y

）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5 種待測(cè)成分回歸方程及線(xiàn)性范圍
Tab 1 Regression equation and linearity of 5 compounds

待測(cè)成分回歸方程r線(xiàn)性范圍/（μg·mL－1）鹽酸麻黃堿 Y ＝2.77×104X ＋2.63×104 0.9999 1.636 ～81.80鹽酸偽麻黃堿Y ＝2.84×104X ＋1.91×104 0.9998 1.207 ～60.35苦杏仁苷Y ＝2.95×104X ＋1.93×104 0.9998 8.609 ～430.45甘草苷Y ＝2.85×104X ＋2.02×104 0.9999 1.304 ～65.20甘草酸Y ＝2.40×104X ＋2.52×104 0.9998 2.539 ～126.95

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄5 種待測(cè)成分色譜峰面積，并計(jì)算峰面積的

RSD

分別為0.9%、0.7%、0.7%、0.9%和1.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：2003065）適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄5 種待測(cè)成分的色譜峰面積。結(jié)果

RSD

分別為1.0%、0.8%、0.7%、1.1%和0.8%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：2003065）6 份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄5 種待測(cè)成分的色譜峰面積并計(jì)算其含量。結(jié)果

RSD

分別為1.2%、1.1%、1.0%、1.3%和1.1%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 回收試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：2003065）0.25 g，共6 份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入5 種待測(cè)成分對(duì)照品儲(chǔ)備液0.7 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5 種待測(cè)成分的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( ＝6)
Tab 2 Recovery ( ＝6)

待測(cè)成分取樣量/g樣品含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%鹽酸麻黃堿0.2503 1.2265 1.1452 2.3315 96.49 98.21.3 0.2511 1.2304 1.1452 2.3517 97.91 0.2504 1.2270 1.1452 2.3644 99.32 0.2520 1.2348 1.1452 2.3462 97.05 0.2517 1.2333 1.1452 2.3613 98.50 0.2509 1.2294 1.1452 2.3704 99.63鹽酸偽麻黃堿0.2503 0.8060 0.8449 1.6622 101.34 101.02.0 0.2511 0.8085 0.8449 1.6548 100.16 0.2504 0.8063 0.8449 1.6327 97.81 0.2520 0.8114 0.8449 1.6752 102.23 0.2517 0.8105 0.8449 1.6640 101.02 0.2509 0.8079 0.8449 1.6821 103.47苦杏仁苷0.2503 6.3126 6.0263 12.5147 102.92 102.81.5 0.2511 6.3327 6.0263 12.5234 102.73 0.2504 6.3151 6.0263 12.5668 103.74 0.2520 6.3554 6.0263 12.6284 104.09 0.2517 6.3479 6.0263 12.5907 103.59 0.2509 6.3277 6.0263 12.3566 100.04甘草苷0.2503 0.9061 0.9128 1.8235 100.51 102.41.3 0.2511 0.9090 0.9128 1.8525 103.37 0.2504 0.9064 0.9128 1.8379 102.04 0.2520 0.9122 0.9128 1.8456 102.25 0.2517 0.9112 0.9128 1.8621 104.18 0.2509 0.9083 0.9128 1.8419 102.28甘草酸0.2503 1.9373 1.7773 3.6523 96.49 97.01.1 0.2511 1.9435 1.7773 3.6651 96.87 0.2504 1.9381 1.7773 3.6929 98.73 0.2520 1.9505 1.7773 3.6617 96.28 0.2517 1.9482 1.7773 3.6833 97.63 0.2509 1.9420 1.7773 3.6496 96.08

2.9 耐用性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液，改變高效液相色譜儀（Agilent 1200 和LC20A）、色譜柱型號(hào)[Agilent Zorbax SB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Capcell pak C（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、柱溫（30℃、40℃和室溫）和流速（0.9、1.0 和1.1 mL·min）等條件，考察對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，各色譜峰的分離度均能滿(mǎn)足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求，表明本方法的耐用性良好。

2.10 樣品測(cè)定

取三拗片6 批，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。按照《中國(guó)藥典》2020年版一部三拗片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿與苦杏仁苷的限度要求（每片含麻黃以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量計(jì)不得少于3.5 mg；每片含苦杏仁以苦杏仁苷計(jì)不得少于6.5 mg），6 批次樣品均符合規(guī)定。

表3 含量測(cè)定結(jié)果 (mg/片， ＝3)
Tab 3 Content determination (mg/片， ＝3)

批號(hào) 鹽酸麻黃堿 鹽酸偽麻黃堿 苦杏仁苷 甘草苷 甘草酸20030652.451.6112.611.813.87 20010252.171.5013.051.933.95 19030632.581.7713.171.653.67 19050332.731.8412.461.994.03 19120752.301.3812.231.533.34 19100132.912.0412.262.004.10

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

參考《中國(guó)藥典》2020年版一部中麻黃、苦杏仁和甘草的含量測(cè)定色譜條件，選擇以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相，并對(duì)梯度條件進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化后的色譜條件下，5 種待測(cè)成分色譜峰峰形良好，且與相鄰的其他色譜峰均分離度良好。采用二極管陣列檢測(cè)器，在200 ～400 nm 內(nèi)采集5 種待測(cè)成分的紫外光譜圖，結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷在近紫外端具有較強(qiáng)的末端吸收，因此選擇205 nm 作為3種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)；甘草苷和甘草酸在237 nm處具有較強(qiáng)的紫外吸收，因此選擇237 nm 作為兩種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。本文采用二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)切換功能，在0 ～15 min 檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為205 nm，15 min 以后切換為237 nm，從而實(shí)現(xiàn)在同一色譜圖上各待測(cè)成分色譜峰均為最強(qiáng)響應(yīng)色譜峰，并提高了檢測(cè)靈敏度。

3.2 提取方式的優(yōu)化

比較了超聲波提取法和加熱回流提取法對(duì)提取效果的影響，結(jié)果兩種方法提取效率沒(méi)有明顯差別，由于超聲波提取法操作簡(jiǎn)單，故選擇超聲波提取法。比較了水、40%甲醇、70%甲醇和甲醇作為提取溶劑的提取效果，由于各待測(cè)成分均為水溶性較強(qiáng)的成分，隨著甲醇濃度增加，各待測(cè)成分的提取效率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；但水相比例較高時(shí)，會(huì)提取出其他干擾成分，使得色譜峰基線(xiàn)不平直，且對(duì)待測(cè)成分色譜峰積分產(chǎn)生較大影響；當(dāng)采用70%甲醇作為溶劑時(shí)，各待測(cè)成分的提取效率較高，且色譜峰基線(xiàn)平直，待測(cè)成分色譜峰積分準(zhǔn)確，因此選擇70%甲醇溶液作為提取溶劑。

三拗片是《中國(guó)藥典》2020年版一部中收載的中成藥制劑，本文采用高效液相色譜波長(zhǎng)切換法，以麻黃、苦杏仁和甘草3 種組方作為研究對(duì)象，對(duì)其中5 種重要的指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確，可為三拗片質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。