梁冬牛，鄭磊，李娟（.山東省立第三醫(yī)院藥學(xué)部，濟南 25003；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，濟南 250033）

三拗片是麻黃、苦杏仁、甘草和生姜組成的中成藥制劑，具有宣肺解表的功效，用于風(fēng)寒襲肺證。其中麻黃具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的作用，而鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿是麻黃的主要功效成分；苦杏仁具有降氣止咳平喘、潤腸通便的作用，其中主要成分為苦杏仁苷；甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用，其中主要功效成分甘草苷和甘草酸具有抗病毒和保護肺組織纖維化作用。三拗片質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2020年版一部，分別采用兩種不同的色譜條件檢測麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿以及苦杏仁中苦杏仁苷的含量以控制組方中麻黃和苦杏仁的質(zhì)量，增加了檢測的復(fù)雜性。目前已發(fā)表的文獻均是以兩種成分作為指標成分控制該制劑的質(zhì)量，本文以三拗片組方中麻黃、苦杏仁和甘草作為研究對象，建立高效液相色譜波長切換法同時測定其中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷和甘草酸5 種指標成分的含量，以有效控制其質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱，日本島津公司），METELER XP205 電子分析天平（精度：0.01 mg，梅特勒公司），KQ-600DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q 超純水機（密理博公司）。

1.2 試藥

鹽酸麻黃堿（批號：171241-201809， 純度：100.0%）、鹽酸偽麻黃堿（批號：171237-201510，純度：99.8%）、苦杏仁苷（批號：110820-201808，純度：88.2%）、甘草苷（批號：111610-201908，純度：95.0%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度：96.2%，甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量/1.0207）（對照品，中國食品藥品檢定研究院），三拗片（規(guī)格：0.5 g/片，批號：2003065、2001025、1903063、1905033、1912075、1910013，濟川藥業(yè)集團有限公司），乙腈（色譜純，Merck公司），磷酸（優(yōu)級純），超純水（實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Capcell pak C（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速為1.0 mL·min；檢測波長為205 nm（鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷），237 nm（甘草苷和甘草酸）；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～8 min，5%A；8 ～13 min，5% ～10%A；13 ～18 min，10% ～20%A；18 ～30 min，20%～50%A）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取本品20 片，除去薄膜衣，精密稱定，研細，精密稱取約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再精密稱定，用70%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品16.36 mg，鹽酸偽麻黃堿對照品12.09 mg，苦杏仁苷對照品97.61 mg，甘草苷對照品13.73 mg，甘草酸銨對照品26.94 mg，分別置10 mL 量瓶中，用70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，質(zhì)量濃度分別為鹽酸麻黃堿1.636 mg·mL，鹽酸偽麻黃堿1.207 mg·mL，苦杏仁苷8.609 mg·mL，甘草苷1.304 mg·mL，甘草酸2.539 mg·mL。精密量取各對照品儲備液2 mL，置同一100 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照《中國藥典》2020年版一部中三拗片處方及制法，分別制備不含麻黃、苦杏仁、甘草的陰性樣品，再按照“2.2.1”項下方法制備不含麻黃、苦杏仁、甘草的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項下空白溶劑（70%甲醇溶液）、混合對照品溶液、供試品溶液與各陰性樣品溶液進樣測定，記錄色譜圖見圖1。結(jié)果5 種待測成分色譜峰峰形良好，且與相鄰色譜峰之間的分離度均符合要求，陰性樣品溶液無干擾。同時采用高效液相色譜儀二極管陣列檢測器對5 種待測成分色譜峰光學(xué)純度進行檢測，結(jié)果均為單一成分的色譜峰。

圖1 三拗片高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of San’ao tablet

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.2”項下對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置100 mL 量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制得5 種待測成分標準系列溶液，進樣測定，以各對照品溶液的質(zhì)量濃度（

X

，μg·mL）為橫坐標，峰面積（

Y

）為縱坐標，進行線性回歸，制備標準曲線方程，結(jié)果見表1。

表1 5 種待測成分回歸方程及線性范圍
Tab 1 Regression equation and linearity of 5 compounds

待測成分回歸方程r線性范圍/（μg·mL－1）鹽酸麻黃堿 Y ＝2.77×104X ＋2.63×104 0.9999 1.636 ～81.80鹽酸偽麻黃堿Y ＝2.84×104X ＋1.91×104 0.9998 1.207 ～60.35苦杏仁苷Y ＝2.95×104X ＋1.93×104 0.9998 8.609 ～430.45甘草苷Y ＝2.85×104X ＋2.02×104 0.9999 1.304 ～65.20甘草酸Y ＝2.40×104X ＋2.52×104 0.9998 2.539 ～126.95

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.2”項下對照品溶液進樣測定，連續(xù)測定6 次，記錄5 種待測成分色譜峰面積，并計算峰面積的

RSD

分別為0.9%、0.7%、0.7%、0.9%和1.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取本品（批號：2003065）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h 進樣測定，記錄5 種待測成分的色譜峰面積。結(jié)果

RSD

分別為1.0%、0.8%、0.7%、1.1%和0.8%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取本品（批號：2003065）6 份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄5 種待測成分的色譜峰面積并計算其含量。結(jié)果

RSD

分別為1.2%、1.1%、1.0%、1.3%和1.1%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 回收試驗

取已知含量的樣品（批號：2003065）0.25 g，共6 份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入5 種待測成分對照品儲備液0.7 mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算5 種待測成分的加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果( ＝6)
Tab 2 Recovery ( ＝6)

待測成分取樣量/g樣品含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%鹽酸麻黃堿0.2503 1.2265 1.1452 2.3315 96.49 98.21.3 0.2511 1.2304 1.1452 2.3517 97.91 0.2504 1.2270 1.1452 2.3644 99.32 0.2520 1.2348 1.1452 2.3462 97.05 0.2517 1.2333 1.1452 2.3613 98.50 0.2509 1.2294 1.1452 2.3704 99.63鹽酸偽麻黃堿0.2503 0.8060 0.8449 1.6622 101.34 101.02.0 0.2511 0.8085 0.8449 1.6548 100.16 0.2504 0.8063 0.8449 1.6327 97.81 0.2520 0.8114 0.8449 1.6752 102.23 0.2517 0.8105 0.8449 1.6640 101.02 0.2509 0.8079 0.8449 1.6821 103.47苦杏仁苷0.2503 6.3126 6.0263 12.5147 102.92 102.81.5 0.2511 6.3327 6.0263 12.5234 102.73 0.2504 6.3151 6.0263 12.5668 103.74 0.2520 6.3554 6.0263 12.6284 104.09 0.2517 6.3479 6.0263 12.5907 103.59 0.2509 6.3277 6.0263 12.3566 100.04甘草苷0.2503 0.9061 0.9128 1.8235 100.51 102.41.3 0.2511 0.9090 0.9128 1.8525 103.37 0.2504 0.9064 0.9128 1.8379 102.04 0.2520 0.9122 0.9128 1.8456 102.25 0.2517 0.9112 0.9128 1.8621 104.18 0.2509 0.9083 0.9128 1.8419 102.28甘草酸0.2503 1.9373 1.7773 3.6523 96.49 97.01.1 0.2511 1.9435 1.7773 3.6651 96.87 0.2504 1.9381 1.7773 3.6929 98.73 0.2520 1.9505 1.7773 3.6617 96.28 0.2517 1.9482 1.7773 3.6833 97.63 0.2509 1.9420 1.7773 3.6496 96.08

2.9 耐用性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液，改變高效液相色譜儀（Agilent 1200 和LC20A）、色譜柱型號[Agilent Zorbax SB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Capcell pak C（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、柱溫（30℃、40℃和室溫）和流速（0.9、1.0 和1.1 mL·min）等條件，考察對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明，各色譜峰的分離度均能滿足系統(tǒng)適用性試驗的要求，表明本方法的耐用性良好。

2.10 樣品測定

取三拗片6 批，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算各成分的含量，結(jié)果見表3。按照《中國藥典》2020年版一部三拗片質(zhì)量標準中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿與苦杏仁苷的限度要求（每片含麻黃以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量計不得少于3.5 mg；每片含苦杏仁以苦杏仁苷計不得少于6.5 mg），6 批次樣品均符合規(guī)定。

表3 含量測定結(jié)果 (mg/片， ＝3)
Tab 3 Content determination (mg/片， ＝3)

批號 鹽酸麻黃堿 鹽酸偽麻黃堿 苦杏仁苷 甘草苷 甘草酸20030652.451.6112.611.813.87 20010252.171.5013.051.933.95 19030632.581.7713.171.653.67 19050332.731.8412.461.994.03 19120752.301.3812.231.533.34 19100132.912.0412.262.004.10

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

參考《中國藥典》2020年版一部中麻黃、苦杏仁和甘草的含量測定色譜條件，選擇以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相，并對梯度條件進行優(yōu)化，在優(yōu)化后的色譜條件下，5 種待測成分色譜峰峰形良好，且與相鄰的其他色譜峰均分離度良好。采用二極管陣列檢測器，在200 ～400 nm 內(nèi)采集5 種待測成分的紫外光譜圖，結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷在近紫外端具有較強的末端吸收，因此選擇205 nm 作為3種成分的檢測波長；甘草苷和甘草酸在237 nm處具有較強的紫外吸收，因此選擇237 nm 作為兩種成分的檢測波長。本文采用二極管陣列檢測器波長切換功能，在0 ～15 min 檢測波長設(shè)置為205 nm，15 min 以后切換為237 nm，從而實現(xiàn)在同一色譜圖上各待測成分色譜峰均為最強響應(yīng)色譜峰，并提高了檢測靈敏度。

3.2 提取方式的優(yōu)化

比較了超聲波提取法和加熱回流提取法對提取效果的影響，結(jié)果兩種方法提取效率沒有明顯差別，由于超聲波提取法操作簡單，故選擇超聲波提取法。比較了水、40%甲醇、70%甲醇和甲醇作為提取溶劑的提取效果，由于各待測成分均為水溶性較強的成分，隨著甲醇濃度增加，各待測成分的提取效率呈現(xiàn)降低的趨勢；但水相比例較高時，會提取出其他干擾成分，使得色譜峰基線不平直，且對待測成分色譜峰積分產(chǎn)生較大影響；當采用70%甲醇作為溶劑時，各待測成分的提取效率較高，且色譜峰基線平直，待測成分色譜峰積分準確，因此選擇70%甲醇溶液作為提取溶劑。

三拗片是《中國藥典》2020年版一部中收載的中成藥制劑，本文采用高效液相色譜波長切換法，以麻黃、苦杏仁和甘草3 種組方作為研究對象，對其中5 種重要的指標成分進行含量測定，結(jié)果準確，可為三拗片質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。