鄒偉靜，朱蘇雨，劉科，席珍，汪潔，袁媛，周菊梅（湖省腫瘤醫(yī)院腹部/淋巴瘤放療科，長沙 410013）

放療是治療盆腔惡性腫瘤最有效的手段之一，但往往導致急性放射性直腸炎與放射性直腸纖維化（radiation-induced rectal fibrosis），成為放療的限制因素。急性放射性直腸炎表現為腹瀉、肛門墜脹等，通常持續(xù)時間短暫，放療結束后數周內緩解。放射性直腸纖維化是直腸受到大劑量的射線照射后引起的損傷后修復過程的代償反應，照射部位長期受到慢性炎癥刺激，相關細胞因子激活，在多種炎性細胞與細胞因子刺激下，成纖維細胞大量增殖與分化為肌成纖維細胞，上皮細胞向間質細胞轉化，導致膠原蛋白等細胞外基質大量分泌和沉積，逐漸發(fā)展成組織纖維化，引起直腸組織功能紊亂，在放療結束后數月發(fā)生，并且不可逆轉。黃芩苷是一種黃酮類成分，在抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要的作用。目前研究發(fā)現黃芩苷還可以減輕肺、腎、肝等器官的纖維化。但是黃芩苷在腸道纖維化方面的作用尚不清楚，其具體機制有待進一步探索。因此，本研究構建大鼠放射性直腸纖維化模型，探討黃芩苷灌腸對放射性直腸纖維化的治療作用。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠90 只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體質量180 ～200 g）。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)于湖南省腫瘤醫(yī)院動物實驗中心7 d，適應環(huán)境，予標準鼠飼料飼養(yǎng)，大鼠自由活動及飲水。實驗動物合格證號：430726200100395016，經科研機構審查委員會及倫理委員會審查批準，實驗動物的操作及處理符合國家《實驗動物管理條例》和有關動物保護與使用的國際法律法規(guī)。

按照體質量將大鼠隨機分成5 組，每組18只，分別為空白對照組、單純放療組、放療＋黃芩苷低劑量組、放療＋黃芩苷中劑量組、放療＋黃芩苷高劑量組。

1.2 儀器及試藥

MultiRad 225 輻射儀（美國Faxitron），生物顯微鏡（德國ZEISS），水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司），蘇木精（Wexis），酸性品紅水溶液（天津市致遠化學試劑有限公司），Masson 染色試劑盒（北京Solarbio 科技有限公司），4%多聚甲醛固定液（西隴科學股份有限公司），黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院，純度：94.2%），抗Ⅰ型膠原蛋白抗體（Abcam 公司）。

2 方法

放療前大鼠禁食不禁水12 h。用7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，等待大鼠肌肉完全松弛，隨后將大鼠平放于輻射儀托盤上，取仰臥位。射野范圍：肛緣至肛緣上5 cm，兩側正中線旁開2 cm，余未照射部位予2.5 cm 厚鉛塊遮蔽。射線類型225 kV-X 射線，源皮距50 cm，劑量率1.5 Gy·min，除空白對照組外其余各組均以16 Gy 劑量單次照射。放療完畢，待所有動物麻醉蘇醒，送返動物中心飼養(yǎng)。

放療次日開始，給藥組分別以50、100、150 mg/（kg·d）黃芩苷灌腸，空白對照組及單純放療組每日以等體積的生理鹽水灌腸，每日1 次，持續(xù)14 d。

2.1 組織學觀察

分別在放療結束后第4 周、8 周、12 周每組麻醉處死6 只大鼠，取直腸組織，長度為肛緣至距肛緣上3 cm，均分3 段，沿縱軸剪開，觀察大體組織并參考文獻標準進行評分（見表1）。將組織固定在配制好的10%甲醛溶液中，行石蠟包埋切片（厚度5 μm），進行HE 及Masson 染色，光鏡評估直腸組織病理改變（見表1 ～2）。

表1 大鼠直腸病理改變評分標準
Tab 1 Scoring criteria of pathological changes in the rectum of rats

組織病理學改變計分炎癥深度隱窩破壞病變范圍無無無無0輕度黏膜下層 基底1/3 破壞1%～25%1中度限于肌層 基底2/3 破壞26%～50%2重度漿膜層僅有完整表面上皮51%～75%3全部隱窩及上皮均破壞 76%～100%4

表2 大鼠直腸纖維化評分標準
Tab 2 Evaluation table for rectal fibrosis in rats

直腸纖維化程度計分無明顯膠原纖維增生及固有基層增厚0膠原纖維輕度增多、固有基層輕度增厚1膠原纖維明顯增多、固有基層明顯增厚2組織結構明顯改變，膠原纖維明顯增多、固有基層明顯增厚3

2.2 免疫組化分析

取各組直腸組織切片，脫蠟水化后，浸入3%過氧化氫溶液中 10 min 以阻斷內源性過氧化物酶，然后將切片在 10 mmol·L檸檬酸鹽緩沖溶液（pH 6.0）中煮沸 8 min 以進行抗原修復，滴加5% 山羊血清孵育 20 min，然后與抗Ⅰ型膠原蛋白抗體（1∶200）在4 ℃孵育 24 h，PBS 洗 3次，室溫孵育二抗 30 min，用 PBS 洗3 次，DAB顯色 5 min，蘇木精復染，蒸餾水沖洗，PBS 返藍，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。陽性表達呈棕黃色或深棕色染色，采用Image J 軟件對陽性表達進行定量分析。

2.3 建模成功判定標準

大鼠進食量、飲水量均下降，大便變稀、出現黏液便或血便等異常，HE 染色鏡下見中至重度炎性變化，Masson 染色可見黏膜下層膠原纖維增多、固有肌層增厚。

2.4 統(tǒng)計分析

以GraphPad 8.0.2 對實驗數據進行統(tǒng)計分析及圖表制作。計量資料結果用“平均值±標準差”表示，使用

t

檢驗以及單因素方差分析來分別比較兩組及多組間的差異，

P

＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 黃芩苷減輕輻射誘導的大鼠大體組織損傷

與空白對照組相比，單純放療組在第4 周、8 周、12 周3 個時間點的大體組織評分均明顯升高（

P

＜0.05）。與單純放療組相比，放療＋黃芩苷低劑量組、放療＋黃芩苷中劑量組、放療＋黃芩苷高劑量組大鼠的大體組織損傷評分均有所下降，且隨著黃芩苷劑量的增高，評分越來越低（

P

＜0.05）（見圖1）。該結果表明黃芩苷干預可有效緩解放療引起的大鼠直腸組織損傷，損傷緩解效果與給藥劑量成正相關，劑量越高，大鼠直腸組織的損傷程度越輕。

圖1 各組大鼠大體組織損傷評分Fig 1 Rat bulk tissue damage scores of each group

3.2 黃芩苷減輕輻射誘導的大鼠直腸組織纖維化

3.2.1 HE 染色 空白對照組在不同時期均黏膜排列整齊，腺體正常，黏膜下層無明顯增厚。接受放療的四組均有不同程度的黏膜損傷，且黏膜下層呈不同程度增厚，其中以單純放療組最為明顯，放療＋黃芩苷高劑量組最輕。對各組大鼠進行病理組織損傷評分，單純放療組的病理評分隨著時間的演變逐漸增加，均顯著高于空白對照組（

P

＜0.05）。黃芩苷干預的三組評分均低于單純放療組（

P

＜0.05），且黃芩苷劑量越高，大鼠直腸組織病理評分越低（見圖2）。結果表明黃芩苷灌腸可以減輕放療后大鼠直腸組織中的黏膜下層增厚，以黃芩苷高劑量組效果最顯著。

圖2 各組大鼠不同時期直腸組織HE 評分及病理改變（×50）Fig 2 Histopathological HE scores of the rectum in of rats（×50）

3.2.2 Masson 染色 空白對照組大鼠直腸組織未見明顯膠原纖維沉積。單純放療組在第4 周時鏡下可見黏膜下層藍色膠原纖維沉積區(qū)，第8 周時膠原沉積區(qū)較第4 周時增厚，在第12 周時，可見黏膜下層明顯增厚，膠原纖維顯著沉積，與空白對照組相比，膠原纖維沉積程度差異具有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。放療＋黃芩苷低劑量組在第4 周、8 周、12 周均可見不同程度的黏膜下層膠原纖維沉積，與同期單純放療組相比，差異均無統(tǒng)計學意義。放療＋黃芩苷中劑量組和放療＋黃芩苷高劑量組在第4 周時未見明顯膠原纖維沉積，第8 周開始均出現不同程度的膠原纖維沉積，但整體上均比同期單純放療組的膠原纖維沉積程度輕，尤其以放療＋黃芩苷高劑量組最輕，差異具有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）（見圖3）。該結果表明黃芩苷中劑量和高劑量組能夠有效減輕放療所致的大鼠直腸組織中的黏膜下層膠原纖維沉積。

圖3 各組大鼠不同時期直腸組織Masson 評分及病理改變（×50）Fig 3 Masson score of pathological tissues in various groups of rats at different times（×50）

3.2.3 免疫組化檢測大鼠直腸組織中Ⅰ型膠原蛋白表達 空白對照組大鼠的直腸組織中Ⅰ型膠原蛋白表達很低。與空白對照組相比，單純放療組的Ⅰ型膠原蛋白在上述3 個時間點每高倍鏡視野下陽性細胞比值顯著增高（

P

＜0.05）。與同期單純放療組的陽性細胞比值相比，放療后接受黃芩苷灌腸的大鼠，其直腸組織的Ⅰ型膠原蛋白陽性細胞比值均出現不同程度降低（

P

＜0.05），且呈劑量依賴性，黃芩苷高劑量組的降低程度最大（見圖4）。該結果表明黃芩苷灌腸可以減輕Ⅰ型膠原蛋白的沉積，以黃芩苷高劑量組的作用最顯著。

圖4 各組大鼠不同時期Ⅰ型膠原蛋白表達情況（×100）Fig 4 CollagenⅠscore of pathological tissues in rats at different times（×100）

4 討論

35%～61%的盆腔惡性腫瘤患者接受過盆腔放療，盡管放療顯著延長了患者的生存時間，但其對正常組織所產生的物理性損傷作用，導致盆腹腔臟器的損傷，其中以直腸損傷最為常見且頑固。放射性直腸纖維化是盆腔放療后常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率為5%～25%，發(fā)生在盆腔放療后的3 ～6 個月以后至數年，主要表現為腹痛、腹瀉、黏液血便、腸梗阻、腸瘺等，臨床診治難度大，患者生活質量受到嚴重影響。目前對于放射性直腸纖維化的機制尚不清楚，缺乏特異性藥物干預。黃芩苷是從唇形科植物傳統(tǒng)中藥黃芩的干燥根中提取的一類黃酮類化合物，是中藥黃芩的主要有效成分，具有解熱抗炎、抗致病微生物感染、抗氧化、抗腫瘤以及免疫調節(jié)等多種藥理作用。

4.1 黃芩苷減輕放射性直腸組織大體損傷和黏膜下纖維化程度

近年來，大量研究表明黃芩苷具有抗多種臟器纖維化的作用。Hu 等的研究發(fā)現，黃芩苷通過TGF-

β

/ SMAD3 通路抑制鼠腎成纖維細胞NRK-49F 的增殖、膠原合成和細胞外基質的沉積，從而產生抗纖維化作用。Huang 等研究結果顯示，博來霉素誘導的小鼠肺纖維化組織中的TGF-

β

和p-ERK1/2 的表達明顯上調，黃芩苷腹腔注射干預后肺纖維化組織中兩者的表達顯著下調，肺組織的纖維化程度減輕。在大鼠肝纖維化模型中，低劑量的黃芩苷能夠降低血清中透明質酸、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原蛋白和羥脯氨酸（HYP）的含量，發(fā)揮抗纖維化作用。黃芩苷在放射性直腸纖維化中的作用需要探討，周雙容等的研究給予黃芩苷[200 和 400 mg/（kg·d）]灌胃處理大鼠放射性直腸纖維化模型，發(fā)現黃芩苷能通過抑制放射所致的直腸組織中成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，降低促炎因子TNF-

α

、IL-6 和IL-1

β

mRNA 的表達，引起直腸隱窩中cleaved caspase-3 表達的上調和Ki-67 表達的抑制，從而減輕放射性輻射所致的腸纖維化損傷。本研究發(fā)現，黃芩苷灌腸可以減輕放射治療對直腸組織的損傷。大體組織觀察以單純放療組直腸組織損傷最為明顯，在第4 周時，主要為腸道組織的充血水腫，狹窄性病變不顯著，隨著時間的演變，在第12 周時表現趨于典型，遠端直腸狹窄性改變，近端腸管擴張，沿縱軸剖開腸管，發(fā)現腸壁明顯增厚和肉眼可見的灰白色纖維化病灶。不同劑量的黃芩苷作用后的各組大鼠直腸組織損傷情況均較單純放療組輕，其中放療＋黃芩苷低劑組緩解程度最小，放療＋黃芩苷高劑量組緩解程度最大。病理HE 染色顯示接受放療的四組均有不同程度的黏膜損傷，黏膜下層呈不同程度增厚，其中以單純放療組最為明顯，經過黃芩苷干預后黏膜下層纖維化程度減輕，其中以黃芩苷高劑量組的黏膜下層增厚程度最輕。

4.2 黃芩苷降低大鼠放射性直腸組織膠原蛋白表達

放療引起受照射部位的組織發(fā)生長期慢性炎癥，相關細胞因子如TGF-

β

、FGF2、IL-6 等分泌增加，刺激成纖維細胞和內皮細胞等分裂與增殖，促進細胞外基質成分的大量分泌，包括Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、透明質酸和層粘連蛋白等，引起上皮細胞向間質細胞轉化，導致組織纖維化形成。

本研究中，Masson 染色證實空白對照組在各時期不出現明顯的黏膜下膠原沉積，而單純放療組和黃芩苷干預組均發(fā)生一定程度的膠原沉積。對于放療后黏膜下層膠原沉積的干預，黃芩苷低劑量的效果不顯著，中劑量和高劑量的效果則比較明顯，且以高劑量的效果最優(yōu)。本研究的免疫組化分析進一步顯示正常大鼠直腸組織中Ⅰ型膠原蛋白表達很少，放療后其表達明顯升高，而接受黃芩苷灌腸的三組大鼠在放療后不同時期直腸組織的Ⅰ型膠原蛋白均出現不同程度的降低，且以黃芩苷高劑量組效果最佳，說明黃芩苷能夠減少放療后直腸組織中包括Ⅰ型膠原蛋白在內的膠原纖維沉積現象，改善受照射大鼠直腸組織的纖維化程度，且呈劑量依賴性。

4.3 黃芩苷治療大鼠放射性直腸纖維化的劑量和灌腸優(yōu)勢

本研究的病理及免疫組化結果均提示黃芩苷可以減輕輻射引起的大鼠直腸組織的纖維化，且以黃芩苷高劑量組效果最佳。對比既往研究，Cai等通過探索不同劑量的黃芩苷[0、100、200、400、800、1600 mg/（kg·d）]對腎臟的作用，發(fā)現過高的黃芩苷劑量[≥400 mg/（kg·d）]的治療可能會引起嚴重的腎臟損傷和纖維化，100 ～200 mg/（kg·d）以下的劑量具有較好的安全性。本實驗使用的黃芩苷劑量范圍為50 ～150 mg/（kg·d），實驗結果表明高劑量可更好地緩解直腸組織的纖維化，大鼠耐受性好而且安全。

不同給藥方式對黃芩苷的吸收速度和程度會有所差異，文獻多采用口服和灌胃給藥研究黃芩苷的抗纖維化作用，但臨床上放化療期間腫瘤患者經常存在惡心嘔吐等上消化道反應，對口服和胃飼藥物的吸收影響較大。本研究采用灌腸方式給藥，藥物吸收不易受上消化道反應的影響。黃芩苷灌腸一方面直接作用于受放療照射的直腸黏膜表面，另一方面通過直腸黏膜滲透吸收可在局部形成較高濃度，有起效快、效果強的潛在優(yōu)勢。如能利用液質聯(lián)用等現代藥物分析技術，監(jiān)測大鼠直腸組織和血液中的黃芩苷濃度變化，建立其與干預放射性直腸纖維化效應的相關性，將能為黃芩苷的量效作用關系提供更有力的依據。