李權(quán)寧，卜艷紅，李遼遼，李東波，馮柯臻，趙正杭（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710061；.西安遠(yuǎn)大德天藥業(yè)股份有限公司，西安 710119；.西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，西安 710061；.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061）

癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征是腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作或異常的行為和感覺(jué)，嚴(yán)重時(shí)喪失意識(shí)，可造成神經(jīng)、認(rèn)知、心理和社會(huì)等后果。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全世界約有7000 萬(wàn)癲癇患者，我國(guó)癲癇的總體患病率約為0.76%，有900 萬(wàn)左右的癲癇患者，其中活動(dòng)性癲癇患者約600 萬(wàn)，同時(shí)每年新增患者約40 萬(wàn)，給家庭和社會(huì)造成了很大的負(fù)擔(dān)。臨床發(fā)現(xiàn)，如果對(duì)癲癇初患進(jìn)行合理治療、用藥，其中70%～80% 可以得到有效控制，在得到控制的患者中，經(jīng)過(guò)2 ～5年治療可以停藥的患者占60%～70%，但仍有約30% 的患者需要經(jīng)多種藥物聯(lián)合治療后依然發(fā)展成為難治性癲癇。目前我國(guó)治療癲癇的藥物種類(lèi)仍嚴(yán)重匱乏，使多數(shù)患者不能得到及時(shí)有效的治療。數(shù)據(jù)顯示，在我國(guó)900 萬(wàn)癲癇患者中，有40.6%的癲癇患者未得到治療，35.4%的治療不正規(guī)。

1999年11月30日UCB Pharma S.A.公司研制的左乙拉西坦（levetiracetam）在美國(guó)首次獲批上市，因臨床療效確切，應(yīng)用廣泛，為方便癲癇患者用藥，隨后該公司相繼又開(kāi)發(fā)了緩釋制劑、口服液及注射液。本研究旨在探索西安遠(yuǎn)大德天藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的仿制藥——左乙拉西坦注射液對(duì)家兔血管的刺激性，為該藥物的上市申請(qǐng)及臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 試藥

左乙拉西坦注射液（規(guī)格：500 mg/5 mL，西安遠(yuǎn)大德天藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：DT20210301）；0.9% 氯化鈉注射液（規(guī)格：100 mL/0.9 g，江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1906144C）；戊巴比妥鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：WS20190411）。

1.2 儀器

電子秤（ALH-30，上海英展機(jī)電）；自動(dòng)染色機(jī)（ST4040，Leica）；光學(xué)顯微鏡（BX41，OLYMPUS）；分體注射泵（SPC，保定申辰）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)新西蘭兔6 只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0 ～3.0 kg，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2019-0005（南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場(chǎng)）。動(dòng)物飼養(yǎng)房間溫度18 ～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，每小時(shí)換氣≥8 次，照明100 ～200 lx，照明時(shí)間12 h。動(dòng)物自由覓食、飲水。

2 方法

2.1 藥物配制

以左乙拉西坦注射液成人患者的臨床最大擬給藥質(zhì)量濃度13 mg·mL為研究給藥質(zhì)量濃度。取左乙拉西坦注射液3 瓶，加入100 mL 的0.9%氯化鈉注射液，配制成質(zhì)量濃度為13 mg·mL的供試品溶液。0.9% 氯化鈉注射液作為對(duì)照溶液。

2.2 給藥劑量

根據(jù)臨床用法用量，推薦左乙拉西坦最大劑量為3000 mg·d，成人平均體質(zhì)量按照60 kg計(jì)算，人用臨床最大劑量為50.00 mg/（kg·d），兔平均體質(zhì)量按2.5 kg 計(jì)算，兔的臨床等效劑量為137.68 mg·kg，本研究設(shè)定兔的給藥劑量為150 mg·kg，約為臨床等效劑量的1.09倍。根據(jù)我國(guó)《化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，該研究設(shè)計(jì)供試品給藥質(zhì)量濃度為13 mg·mL、給藥容量為5.8 mL·kg，給藥速率為1 mL·min，給藥頻次為2 次·d、連續(xù)3 d。對(duì)照組給藥容量、給藥速率、給藥頻次及周期同用藥組。

2.3 研究方案

取6 只新西蘭兔，采用自身對(duì)照，微量注射泵耳緣靜脈注射，左耳給左乙拉西坦注射液，右耳給0.9% 氯化鈉注射液，每日2 次，連續(xù)3 d。于末次給藥72 h 后處死4 只動(dòng)物（雌雄各半），剩余2 只動(dòng)物繼續(xù)觀察，14 d 后處死。動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)取材，包括進(jìn)針部位及耳緣靜脈的整個(gè)耳組織，固定于12% 福爾馬林液中。最后進(jìn)行脫水、包埋、蘇木素伊紅（HE）染色和光鏡檢查。

2.4 結(jié)果評(píng)價(jià)

2.4.1 肉眼觀察 給藥期詳細(xì)觀察每次給藥后的60 min 及末次給藥后72 h 內(nèi)左、右耳注射液部位及周邊組織的刺激反應(yīng)。在恢復(fù)期，每日肉眼觀察注射部位及周?chē)M織的刺激反應(yīng)情況。刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：“0”表示無(wú)明顯刺激性、“1”表示紅斑、“2”表示水腫、“3”表示潰瘍；嚴(yán)重程度：“＋”表示輕微，“＋＋”表示明顯，“＋＋＋”表示嚴(yán)重。

2.4.2 組織病理學(xué)檢查 在剖檢時(shí)肉眼觀察耳緣靜脈的刺激性反應(yīng)。從耳尖到耳根取近、中、遠(yuǎn)三段，從耳尖到耳根，距進(jìn)針部位約1.3 cm 為近段，距進(jìn)針部位約2.6 cm 為中段，距進(jìn)針部位約4.0 cm 為遠(yuǎn)段。取材范圍可根據(jù)進(jìn)針情況適當(dāng)放長(zhǎng)。最后脫水、包埋、HE 染色和光鏡檢查。所有形態(tài)改變根據(jù)輕重標(biāo)記為“±”“＋”“＋＋”“＋＋＋”，分別表示輕微、輕度、中度、重度，無(wú)病變標(biāo)記為“－”，缺失記“無(wú)”。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物一般狀況

在給藥期，每次給藥后的60 min 及末次給藥后72 h 內(nèi)及恢復(fù)期，兔活動(dòng)、睡眠及其他精神狀態(tài)良好，未見(jiàn)有明顯的給藥引起的不良反應(yīng)；兔毛發(fā)光澤順滑，飲食、飲水正常，排便、排尿未見(jiàn)異常。給藥后72 h 和恢復(fù)期14 d 兔的體質(zhì)量變化也未見(jiàn)明顯異常（

P

＝0.157），給藥前后動(dòng)物體質(zhì)量變化如表1。

表1 給藥前后動(dòng)物體質(zhì)量變化
Tab 1 Changes of animal body mass before and after administration

編號(hào)性別體質(zhì)量/kg給藥前末次給藥后72 h恢復(fù)期14 d 1001♂2.♂2.62.6/100293.03.0 1003♂2.93.0/1004♀2.72.7/1005♀2.52.5/1006♀2.72.72.8

3.2 注射部位觀察與評(píng)價(jià)

在給藥期，用藥組一只兔左耳緣靜脈出現(xiàn)了輕微紅斑癥狀，末次給藥結(jié)束觀察72 h 基本恢復(fù)正常；對(duì)照組一只兔右耳緣靜脈出現(xiàn)了輕微紅斑癥狀，末次給藥結(jié)束觀察72 h 基本恢復(fù)正常?；謴?fù)期，各例兔耳血管未見(jiàn)明顯的刺激性癥狀。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 注射部位及周?chē)M織肉眼觀察刺激性評(píng)分表
Tab 2 Visual irritation scores of injection site and surrounding tissues

程度刺激性嚴(yán)重程度編號(hào)組別給藥期末次給藥后72 h恢復(fù)期刺激性嚴(yán)重程度刺激性嚴(yán)重1001 用藥組0000//對(duì)照組0000//1002 用藥組1＋0000對(duì)照組000000 1003 用藥組0000//對(duì)照組0000//1004 用藥組0000//對(duì)照組1＋00//1005 用藥組0000//對(duì)照組0000//1006 用藥組000000對(duì)照組000000

3.3 病理學(xué)結(jié)果

3.3.1 給藥結(jié)束 ① 肉眼檢查：各例兔耳皮膚組織未見(jiàn)破潰，無(wú)腫脹，無(wú)局部紅斑等異常改變；② 鏡下檢查：各例兔耳血管管壁完整，各層組織正常，兔耳血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)腫脹、壞死、脫落，管腔內(nèi)無(wú)血栓形成，管周無(wú)充血、水腫、出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病理學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 給藥結(jié)束時(shí)給藥部位及周邊組織病理學(xué)檢查（HE，×200）Fig 1 Histopathological examination of administration sites and surrounding area after administration（HE，×200）

3.3.2 恢復(fù)期 ① 肉眼檢查：各例兔耳皮膚組織未見(jiàn)破潰，無(wú)腫脹，無(wú)局部紅斑等異常改變；②鏡下檢查：各例兔耳血管管壁完整，各層組織正常，血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)腫脹、壞死、脫落，管腔內(nèi)無(wú)血栓形成，管周無(wú)充血、水腫、出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病理學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 恢復(fù)期給藥部位及周邊組織病理學(xué)檢查（HE，×200）Fig 2 Histopathological examination of administration sites and surrounding tissues during recovery（HE，×200）

4 討論

2017年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟將癲癇發(fā)作類(lèi)型分為全面性、局灶性和其他三類(lèi)。癲癇發(fā)作時(shí)患者會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)及意識(shí)障礙、抽搐、嚴(yán)重時(shí)意識(shí)喪失，治療不及時(shí)會(huì)影響生命安全。口服給藥時(shí)，藥物經(jīng)胃腸道吸收，存在首過(guò)效性，生物利用度較低，不能達(dá)到快速控制病情的效果。而且，大部分患者癲癇發(fā)作時(shí)無(wú)法經(jīng)口給藥。而注射劑直接入血，生物利用度高，起效迅速，可以在癲癇發(fā)作時(shí)及時(shí)控制病情，保證患者的生命安全。

左乙拉西坦已上市多年，其有效性和安全性已在臨床中得到充分驗(yàn)證。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)左乙拉西坦在大鼠腦組織中有一個(gè)立體選擇性、飽和的神經(jīng)元結(jié)合位點(diǎn)，而且該結(jié)合位點(diǎn)是參與了囊泡胞吐調(diào)控的突觸囊泡蛋白2A（SV2A）。雖然人們暫未獲知左乙拉西坦與SV2A 相結(jié)合的具體意義，但其在抗癲癇聲源性模型（ASG）中表現(xiàn)出與SV2A 親和力相關(guān)，因此左乙拉西坦的抗癲癇作用機(jī)制可能與SV2A 結(jié)合有關(guān)。

左乙拉西坦注射液為患者口服給藥暫不可行時(shí)的替代產(chǎn)品，成人患者最大日推薦給藥劑量為3000 mg，每日兩次，每次1500 mg。每次給藥前取左乙拉西坦注射液（規(guī)格：500 mg/5 mL）3 瓶溶解在100 mL 的溶劑中，配制最終質(zhì)量濃度為13 mg·mL，然后在15 min 內(nèi)注射完畢。臨床用藥中，通常需將不同量的藥物溶解在100 mL 溶劑中，但兒科患者的給藥容量較小，稀釋后的最終質(zhì)量濃度不應(yīng)超過(guò)15 mg·mL。考慮到臨床常用劑量及給藥方法，此次血管刺激性研究的濃度以成人患者臨床擬給藥質(zhì)量濃度為依據(jù)，確定為13 mg·mL。

UCB Pharma S.A.公司研制的左乙拉西坦注射液（原研藥物）的刺激性研究顯示了其具有良好的耐受性，該研究連續(xù)5 d 對(duì)家兔靜脈注射質(zhì)量濃度為15 mg·mL的左乙拉西坦注射液，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，有家兔在給藥部位出現(xiàn)表皮增生、炎癥及出血現(xiàn)象，研究者認(rèn)為該現(xiàn)象與給藥方法和給藥濃度有關(guān)，有可能由正常操作引起。本次研究連續(xù) 3 d 對(duì)家兔耳緣靜脈注射質(zhì)量濃度為13 mg·mL的左乙拉西坦注射液（仿制藥），同樣有家兔在給藥部位出現(xiàn)輕微紅斑，但給藥結(jié)束后72 h 已經(jīng)恢復(fù)正常，由于對(duì)照組也有家兔出現(xiàn)了輕微紅斑，因此該現(xiàn)象極有可能是操作引起的物理性損傷，而非藥物本身的藥理作用。因此，仿制藥左乙拉西坦注射液按給藥劑量為150 mg/（kg·d），每日2 次，連續(xù)3日，對(duì)家兔耳血管未見(jiàn)明顯的刺激性作用，與原研藥物相關(guān)研究結(jié)果相似，符合2014年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心頒布的《化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，可用于上市注冊(cè)申請(qǐng)。