葛佳佳，楊娜，張瀟莉，沈山梅，葛衛(wèi)紅*（.中國藥科大學南京鼓樓醫(yī)院，南京 0008；.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院，南京 0008；.南京中醫(yī)藥大學，南京 00）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見的生殖內(nèi)分泌疾病，發(fā)病率介于5%～20%，表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕、高雄激素血癥、多毛、痤瘡和卵巢多囊樣改變等。其發(fā)病機制復雜且尚未明確，可能與性激素代謝紊亂相關。其中高雄激素血癥被普遍認為是PCOS 關鍵的病理生理改變，雄激素水平尤其是睪酮（testosterone，T）指標的準確定量對PCOS 的診斷至關重要。在臨床，醫(yī)師還會對其他PCOS 相關的性激素水平進行評估以加強診斷和鑒別診斷。雌激素是類固醇激素代謝的下游物質(zhì)，與雄激素的代謝緊密相關。雌二醇（estradiol，E2）是生物活性最強的一種雌激素，也是PCOS診斷和藥物治療的一項重要評估指標。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法是雄激素測定的金標準。該方法結合了液相色譜儀器的分辨力以及質(zhì)譜的高特異性，可從少量樣品中分析多種物質(zhì)，具有更高的準確度、精密度和靈敏度。但在實際的臨床實踐中，醫(yī)院多采用化學發(fā)光免疫法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）測定性激素。它是一種結合化學發(fā)光和免疫分析的檢測方法，操作簡單、檢測速度快，而且具備較高的檢測靈敏度。本研究使用LCMS/MS 法測定與PCOS 發(fā)生、診斷最為密切相關的T 和E2 兩種性激素水平，并與臨床上CLIA法的檢測結果進行比較分析。

1 材料

為提高一致性檢驗的準確程度，根據(jù)Bland等的推薦，采用Bland-Altman 分析的樣本量最好達到100 例。因此，本研究收集了2020年1—6月就診于南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院婦科門診并符合2003年鹿特丹診斷標準的PCOS 患者100 例。納入標準：① 稀發(fā)排卵或無排卵；②高雄激素血癥或高雄激素臨床表現(xiàn)（脂溢性皮炎、多毛、痤瘡等）；③ 任意一側(cè)卵巢內(nèi)直徑2 ～9 mm 的未成熟卵泡＞12 個或卵巢體積＞10 mL；符合以上任意兩條即可。排除標準：① 其他引起類似PCOS 癥狀的疾病，如甲亢、高泌乳素血癥、腎上腺疾病等；② 合并其他重大疾病、腫瘤患者；③ 妊娠女性。

2 方法

2.1 化學發(fā)光免疫法

采用CLIA 法測定血清中T 和E2 的濃度。所用儀器為西門子全自動化學發(fā)光免疫分析儀（德國，Atellica/IH01375），檢測所需試劑均為配套試劑，按規(guī)定的要求操作。剩余血清于－80℃冰箱保存，留作LC-MS/MS 分析法測定。

2.2 LC-MS/MS 法

使用Waters ACQUITY UPLC I-Class/XEVO TQD 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定T 和E2 的濃度。 對照品T（純度：99.2%， 批號：G157843，德國DR.E），E2（純度：96.3%，批號：100182 ～201205，中國食品藥品檢定研究院），內(nèi)標睪酮-d3（T-d3，純度 98%，美國Sigma）和雌二醇-d4（E2-d4，純度 98%，加拿大TRC）。參考本實驗室前期建立的方法，采用液液萃取方法進行前處理，色譜柱為Waters BEH C（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），等度洗脫（70%B）。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，MRM 離子對分別為：T：289.3 →97.04，T-d3：292.32 →97.03，E2：506.27 →171.05，E2-d4：510.27 →171.05。本方法T 和E2 的線性范圍均為3 ～300 nmol·L（

r

＞0.995）。該LC-MS/MS 方法已由本實驗室參考生物樣品定量分析方法驗證指導原則完成方法學考察。

2.3 統(tǒng)計方法

采用 SPSS 26 軟件，兩種方法測得的數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示。兩種方法測定數(shù)據(jù)的差值符合正態(tài)分布且差值不隨均值增大而增大時，使用Medcalc 軟件直接進行Bland-Altman 分析；當差值明顯隨著均值增大而增大時，對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行Bland-Altman 分析，以評估CLIA 法與LC-MS/MS 法的一致性。使用配對

t

檢驗和Pearson 相關性分析進行整體數(shù)據(jù)的比較，

P

＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 兩種檢測方法的結果比較

將CLIA 法和 LC-MS/MS 法測定的T、E2血清濃度進行比較分析，結果見圖1。CLIA 法檢測T、E2 濃度的平均值分別為（1.45±0.43）nmol·L和（0.17±0.08）nmol·L。LC-MS/MS 法測定的T、E2 的平均值分別為（1.48±0.74）nmol·L和（0.11±0.07）nmol·L。將兩組檢測結果進行配對樣本

t

檢驗，結果兩種檢測方法測得T 濃度差異無統(tǒng)計學意義（

P

＝0.54），測得E2 濃度差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.001）。

圖1 CLIA 法和LC-MS/MS 法測定的結果（****P ＜0.0001）Fig 1 Results of CLIA method and LC-MS/MS method（****P ＜0.0001）

3.2 兩種檢測方法的相關性和一致性分析

為進一步比較 CLIA 法和 LC-MS/MS 法的測定結果，利用100 個樣本分別進行Pearson 相關性分析和Bland-Altman 一致性分析。在Pearson相關性分析中，T 和E2 的相關系數(shù)分別為 0.774和0.883（

P

均＜0.001），兩種檢測方法的結果呈強度相關。在Bland-Altman 一致性分析中，100 例配對數(shù)據(jù)的T 的比值的均數(shù)是104.95%（95%

CI

：98.97%～111.28%），一致性下限為58.83%（95%CI: 53.19% ～65.04%）， 一致性上限為187.2%（95%

CI

：169.32% ～207.0%）；100 例配對數(shù)據(jù)的E2 的差值的均數(shù)是0.065（95%

CI

：0.057 ～0.072），一致性下限為－0.009（95%

CI

：－0.022 ～0.004），一致性上限為0.139（95%

CI

：0.126 ～0.152），Bland-Altman 圖見圖2。

圖2 兩種檢測方法測定結果的Bland-Altman 圖Fig 2 Bland-Altman diagram of detection results by 2 methods

從圖中可以看出，T 和E2 均有4%（4/100）的點在一致性界限外。在一致性界限范圍內(nèi)，T 比值的最大值為1.87，最小值為0.58。說明CLIA 法測量的T 是LC-MS/MS 法的0.58 ～1.87倍，即CLIA 法的測量結果與LC-MS/MS 測量結果最大相差87%；在一致性界限范圍內(nèi)，E2 差值的最大值為0.144 nmol·L，兩種測量方法的E2 平均值為0.141 nmol·L；從臨床上考慮，T 和E2 測量結果相差的幅度均是不能接受的，兩種檢測方法的一致性不佳。

3.3 兩種檢測方法對高雄激素血癥診斷的分析

依據(jù)2018年多囊卵巢綜合征診治內(nèi)分泌專家共識，高雄激素血癥是PCOS 的診斷內(nèi)容之一，且由于不同的測定方法和參考范圍，測定值高于當?shù)嘏詤⒖挤秶恼Ｉ舷藜纯煽紤]高雄激素血癥，故采用本院根據(jù)當?shù)嘏訲 濃度制訂出來的參考區(qū)間：0.3 ～1.66 nmol·L，即CLIA 法采用T ＞1.66 nmol·L診斷為高雄激素血癥。CLIA 法共確定了28 名（28%）高雄激素血癥患者。LC-MS/MS 法的結果采用Yang 等在中國人群中利用質(zhì)譜法建立的高雄激素血癥標準：T ＞1.85 nmol·L。使用 LC-MS/MS 方法最終確定24 名（24%）高雄激素血癥的PCOS 患者。

值得注意的是，盡管通過CLIA 法與LC-MS/MS 法識別為高雄激素血癥的 PCOS 女性的百分比相似，但在將個體分配到高雄激素血癥和非高雄激素血癥的類別中存在一定的不匹配（見圖3）。以金標準（LC-MS/MS）作為參考，總共100 名女性中有16 名（16%）被CLIA 法不恰當?shù)胤诸悺Ｆ渲校?0 例患者出現(xiàn)假陽性，6 例患者出現(xiàn)假陰性。

圖3 PCOS 女性通過CLIA 測定方法確定為高雄激素血癥或非高雄激素血癥的情況Fig 3 PCOS women identified as hyperandrogenemic or normoandrogenemic by CLIA assay

4 討論

性激素的測定，尤其是T 對PCOS 的臨床診斷和治療具有一定的參考價值，其最終的結果必須準確、特異和靈敏。本研究通過CLIA 法和 LCMS/MS 法對100 名PCOS 患者的血清T、E2 進行測定，并進行兩組數(shù)據(jù)的比較和分析。結果表明，盡管兩種檢測方法之間存在總體適度的相關性，但并不能充分反映它們之間的一致性。Bland-Altman 一致性分析的結果表明，CLIA 法和LC-MS/MS 法在測定性激素水平方面一致性不佳，CLIA 法測定的性激素水平普遍偏高，高雄激素血癥的假陽性率和假陰性率也較高。

高雄激素血癥對PCOS 的診斷具有重要參考意義。卵巢中膜細胞的雄激素生成增加已被證明，在PCOS 中進行準確的雄激素測量非常重要。本研究結果與Salameh 等的研究一致，通過LC-MS/MS 和免疫測定法的T 指標具有較強的相關性。但是在一致性評價中，與金標準LC-MS/MS 測定法相比，CLIA 法并沒有表現(xiàn)出一致的檢測水平。而且對PCOS 患者進行個體評估時，可能會受到某些因素的影響而發(fā)生數(shù)據(jù)偏差，CLIA 法的假陽性率為15.2%，假陰性率為25%，這與Tosi 等的研究結果相似?？赡苁怯捎贑LIA 法極易受環(huán)境影響，穩(wěn)定性差的原因。

此外，結果還顯示兩種檢測方法測定的E2水平存在顯著差異，在以往的文獻中尚未有類似的研究。人們多關注雄激素的變化，但在整個類固醇代謝譜中，雌激素、孕激素和雄激素的變化緊密關聯(lián)。測定雌激素等其他性激素對PCOS 的診斷和治療也是十分必要的。本研究中CLIA 法測得的雌激素水平明顯被高估，這可能是因為性激素之間的化學結構高度類似，CLIA 法容易發(fā)生免疫交叉反應，無法特異性區(qū)分E2 和其他性激素。

目前，CLIA 法因其操作簡便、易實現(xiàn)自動化等優(yōu)勢在許多實驗室和醫(yī)院中廣泛使用。但由于易受相關內(nèi)源性物質(zhì)、外界環(huán)境、基質(zhì)效應等的干擾，其對于性激素測定的特異性和可靠性存在疑問。相比于免疫測定方法，LC-MS/MS 法具有所需樣品體積小、靈敏度和特異性大大提高，動態(tài)范圍大，可同時檢測多種性激素的優(yōu)勢，成為定量性激素的金標準，并逐漸被應用于一些具備條件的臨床實驗室中。在未來，越來越成熟的LC-MS/MS 法將取代各種免疫法成為性激素研究的主要方法，臨床上應積極滿足建立LC-MS/MS 法相關的設備、軟件、訓練有素的員工等條件，將LC-MS/MS 技術廣泛應用于精確的性激素的測定等臨床項目。