雷芳，伍丹情，費清松，羅芮，何寧，2，3，4*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，合肥 23002；2.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點實驗室，合肥 23002；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 23002；4.現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)研究中心，合肥 23002）

復(fù)方丹參方是上海中藥二廠于1977年研制成功并投產(chǎn)的經(jīng)典名方，由丹參、三七和冰片三味中藥組成，具有活血通絡(luò)、理氣止痛的功效，臨床可用于治療心腦血管相關(guān)疾病。目前，復(fù)方丹參方已有六種劑型收載于2020年版《中國藥典》，復(fù)方丹參滴丸更是全球首例完成美國FDAⅢ期臨床研究（NCT01659580）的中藥復(fù)方制劑，臨床治療心絞痛、冠心病有很好的療效。除了劑型和丹參量的不同，制劑過程中丹參、三七提取工藝造成的活性組分差異性也會影響療效。丹參水溶性成分的藥效遠高于其脂溶性成分，近年來丹參水溶性成分治療心血管疾病的潛力被慢慢發(fā)掘，臣藥三七與之合煎時有助于丹參成分溶出和含量穩(wěn)定，因此研究復(fù)方丹參方中丹參和三七合提時的水提工藝是十分有意義的。

復(fù)方丹參方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為親脂性二萜類、親水性酚酸類及三七皂苷三大類化合物。丹參素是丹參中一種水溶性酚酸，具有改善血液流變學(xué)、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等藥理作用，屬于冠心病治療的關(guān)鍵藥性成分，同時也是藥典中復(fù)方丹參滴丸的含量測定成分。三七皂苷是三七的質(zhì)量控制指標成分，藥理學(xué)研究表明三七皂苷具有降低耗氧、擴張血管、抑制血小板聚集等作用。本文建立UHPLC 含量測定方法，同時測定丹參素鈉、人參皂苷Rg，并在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)三七皂苷中人參皂苷 Rg1 在大鼠血漿和組織中含量較高，考慮到后期大鼠體內(nèi)研究，最終選擇人參皂苷Rg作為提取工藝評價指標之一。

中藥材煎煮后的藥液若不經(jīng)醇沉、水沉等處理會含有多糖、淀粉、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，不能進行注射或眼用，除雜過程也伴隨著有效成分的損失。本課題組前期工作已證實藥物經(jīng)眼全身遞送的可行性，且冰片因其易揮發(fā)的性質(zhì)一般在藥材提取完成后加入，因此本文以丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量為評價指標，使用AHPCRITIC 法確定權(quán)重系數(shù)，參考復(fù)方丹參滴丸的制備工藝，正交設(shè)計優(yōu)選出復(fù)方丹參方中丹參與三七的水提工藝，并考察水煎液在醇沉調(diào)堿和水沉調(diào)酸過程中pH 對評價指標的影響，為后期復(fù)方丹參方的眼用制劑研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate3000 戴安超高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHK-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司）；HH-501 超熱恒溫水浴（金壇市晶玻實驗儀器廠）；DHG-9640AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱（常州普天儀器制造有限公司）；PHS-3C 型pH 計（上海三信儀表廠）。

1.2 試藥

丹參（批號：DS21-01）、三七（批號：SQ21-01）（安徽華貅藥業(yè)有限公司）；丹參素鈉對照品（批號：PS000270，純度≥98%）、人參皂苷Rg對照品（批號：DST180323-009，純度≥98%）（成都德思特生物技術(shù)有限公司）；95%乙醇、氫氧化納、鹽酸、磷酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水，甲醇和乙腈均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參素鈉和人參皂苷Rg1 的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Accucore C（100 mm×4.6 mm，2.6 μm），流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脫，見表1，流速：0.3 mL·min，檢測波長：280 nm（丹參素鈉）、203 nm（人參皂苷Rg），柱溫：30℃，進樣量：1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

時間/min乙腈（A）/%0.2%磷酸水（B）/%0 1090 6 1090 8 2179 112575 183367 284060

2.1.2 溶液的制備 精密稱取丹參素鈉、人參皂苷Rg對照品各10 mg，分別置于5 mL 棕色量瓶中，加70%甲醇制備成質(zhì)量濃度為2 mg·mL的儲備液，備用。分別精密吸取丹參素鈉、人參皂苷Rg儲備液適量，加70%甲醇稀釋成每1 mL 分別含1 mg 丹參素鈉、1 mg 人參皂苷Rg的混合對照品溶液。

精密稱取45 g 丹參、8.8 g 三七于砂鍋中，加入10 倍量超純水，浸泡45 min 后煎煮2.5 h，煎液經(jīng)紗布趁熱過濾，離心后取上清液濃縮至50 mL，加適量乙醇至含醇量為75%，靜置一夜，過濾，回收乙醇，濃縮并定容至50 mL 量瓶中；精密吸取適量復(fù)方丹參提取液，加70%甲醇稀釋20倍，3000 r·min渦旋3 min，15 000 r·min離心10 min，離心兩次，取上清液，即得。

分別按上述供試品溶液的制備方法制備缺丹參、缺三七的陰性樣品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系的考察 分別取“2.1.2”項下混合對照品溶液0.125、0.25、0.5、1、2、3 mL 置于5 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，按“2.1.1”項下色譜條件測定并繪制標準曲線。結(jié)果丹參素鈉、人參皂苷Rg的線性回歸方程分別為

y

＝0.0297

x

＋0.0933、

y

＝0.012

x

－0.0231，

R

均為0.9999。表明丹參素鈉和人參皂苷Rg在25 ～600 μg·mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 專屬性考察 取“2.1.2”項下各溶液進樣1 μL 進行測定，結(jié)果見圖1，待測組分與相鄰峰的分離度均大于1.5，且各峰之間并無干擾，該方法的專屬性良好。

圖1 供試品（a）、對照品（b）、陰性供試品（c）的UPLC 色譜圖Fig 1 UHPLC chromatograms of sample（a），reference（b），negative（c）

2.1.5 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液適量，連續(xù)測定6 次，記錄峰面積。丹參素鈉峰面積的

RSD

為1.1%，人參皂苷Rg峰面積的

RSD

為0.29%，表明儀器的精密度較好。2.1.6 重復(fù)性考察 取適量復(fù)方丹參供試品溶液，平行制備6 份，進樣測定，結(jié)果丹參素鈉和人參皂苷Rg含量的

RSD

分別為1.6%、1.9%，均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。2.1.7 樣品溶液穩(wěn)定性考察 取同一批復(fù)方丹參供試品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24 h 進樣，結(jié)果丹參素鈉、人參皂苷Rg峰面積的

RSD

分別為0.50%、0.38%（

n

＝6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。2.1.8 加樣回收率考察 精密吸取適量供試品溶液（丹參素鈉、人參皂苷Rg含量分別為73.70 μg、57.85 μg）于5 mL 量瓶中，共6 份，每份精密加入適量混合對照品溶液（丹參素鈉、人參皂苷Rg含量分別為78.13 μg、56.53 μg），70%甲醇定容至刻度，進樣測定，測得丹參素鈉、人參皂苷Rg的平均加樣回收率分別為101.41%、98.67%，

RSD

分別為1.3%、0.53%，表明方法回收率良好。

2.2 總固體含量測定

精密吸取10 mL 提取液于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h，冷卻并稱定重量，計算總固體含量。

2.3 單因素實驗

本實驗以丹參素鈉、人參皂苷Rg的含量為考察指標，結(jié)合相關(guān)文獻考察了粒徑、加水量、浸泡時間、提取時間、提取次數(shù)對復(fù)方丹參方水提工藝的影響。粒徑考察中發(fā)現(xiàn)丹參、三七藥材經(jīng)打粉機粉碎后大多能通過七號篩，由于飲片整體硬度不一致，通過二、三號篩的基本為外表皮部或韌皮部，而木栓部能通過九號篩，這說明藥材過篩后存在部位差異性，無法保持單一變量進行單因素實驗。浸泡時間的結(jié)果發(fā)現(xiàn)浸泡45 min后藥材的提取效果最好，故藥材煎煮前統(tǒng)一浸泡45 min。而對加水量、提取時間、提取次數(shù)的考察發(fā)現(xiàn)隨著因變量的增大，有效成分的含量也隨之增大，單因素實驗結(jié)果見圖2。

圖2 單因素實驗結(jié)果Fig 2 Single factor experiment

2.4 正交實驗設(shè)計

根據(jù)前期單因素實驗結(jié)果確定了考察因素，并以丹參素鈉、人參皂苷Rg及總固體含量為考察指標，用L（3）正交設(shè)計表進行實驗。因素水平見表2。

表2 因素水平表
Tab 2 Factor and level

水平因素加水量/A提取次數(shù)/B提取時間/C 1 8 1 1.5 2 1022.0 3 1232.5

2.5 指標權(quán)重的確立

2.5.1 層次分析法（AHP）法AHP 是將決策者的經(jīng)驗判斷予以量化的主觀權(quán)重賦權(quán)法。本文以丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量作為權(quán)重指標予以量化，依據(jù)丹參、三七君臣配伍原則，指標優(yōu)先順序為丹參素鈉含量＞人參皂苷Rg含量＞總固體含量，采用1 ～9 標度法評判兩兩指標之間的重要性并構(gòu)造成對比較矩陣A，見表3。按式（1）計算矩陣A 中每一行元素乘積的

n

次方根

β

，對

β

＝（

β

，

β

，…，

β

）歸一化后得到特征向量W ＝（W，W，…，W），即（0.7306，0.1884，0.0810）。

表3 指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣
Tab 3 Priority judgment matrices for pairwise comparison of indicators

權(quán)重指標含量（mg·g－1）丹參素鈉人參皂苷Rg1總固體丹參素鈉含量157人參皂苷Rg1 含量 1/513總固體含量 1/7 1/31

根據(jù)式（2）計算出矩陣最大特征值

λ

為3.0649，（AW）表示向量AW 的第

i

個元素，最后通過公式C.I.＝（

λ

－

n

）/（

n

－1）和C.R.＝C.I./R.I.計算出一致性檢驗指標（C.R.）＝0.0624 ＜0.10，即構(gòu)造的成對比較矩陣具有滿意的一致性，權(quán)重系數(shù)分別為0.7306、0.1884、0.0810。2.5.2 CRITIC 法CRITIC 法是完全依據(jù)數(shù)據(jù)本身的客觀屬性而科學(xué)評價的的客觀賦權(quán)法。首先對表4 中的原始數(shù)據(jù)進行無量綱化處理[指標成分值＝（實測值－最小值）/（最大值－最小值）]，經(jīng)MATLAB 處理后得到相關(guān)系數(shù)矩陣B和各指標對比強度（

S

），再通過下列公式計算出沖突性（

R

）、信息量（

C

）與權(quán)重（

W

），結(jié)果見表5。

表4 正交實驗設(shè)計及結(jié)果
Tab 4 Design and result of orthogonal experimental

No.A B CD（誤差）含量（mg·g－1）綜合評分丹參素鈉 人參皂苷Rg1 總固體111111.93884.36390.1918 47.93 212223.44624.90680.2398 74.97 313334.55345.41710.2593 94.89 421232.37603.93250.2178 54.24 522313.99084.85160.2392 83.68 623124.06457.07600.2698 92.02 731323.00804.21000.2212 65.43 832133.41725.85700.2546 77.58 933213.79256.14180.2608 84.66

表5 CRITIC 法相關(guān)計算數(shù)據(jù)(mg·g)
Tab 5 CRITIC method related calculation data (mg·g)

－1考察指標丹參素鈉Sj0.3204 Rj0.4423含量（mg·g）人參皂苷Rg1總固體0.32550.3228 0.47740.2513 Cj0.14170.15540.0811 Wj0.37470.41090.2144

（注：

r

表示評價指標

i

和

j

之間的相關(guān)系數(shù)）

由表5 可知，CRITIC 法計算出的丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.3747、0.4109、0.2144。

2.5.3 AHP-CRITIC 法AHP-CRITIC 法是由AHP 法和 CRITIC 法混合加權(quán)得到的方法，計算公式為

W

＝（WAHP×WCRITIC）/∑（WAHP×WCRITIC），

i

為第

i

個因素；

j

為第

j

個樣本。AHP-CRITIC 混合加權(quán)法計算出的丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量綜合權(quán)重系數(shù)分別為0.7428、0.2101、0.0471。2.5.4 綜合評分比較通過上述3 種計算方法得到相應(yīng)的3 組權(quán)重系數(shù)，綜合評分后的結(jié)果見表6。綜合評分＝[（丹參素鈉含量/丹參素鈉最大含量）×0.7428 ＋（人參皂苷Rg含量/人參皂苷Rg最大含量）×0.2101 ＋（總固體含量/總固體最大含量）×0.0471]×100。采用MATLAB 軟件對3 種計算方法進行相關(guān)系數(shù)分析。AHP 法與AHP-CRITIC 法的相關(guān)系數(shù)為1.000，CRITIC 法與AHP-CRITIC 法的相關(guān)系數(shù)為0.9715，AHP 法與CRITIC 法的相關(guān)系數(shù)為0.9703，3 組均有顯著相關(guān)性（

P

＜0.01），說明3 種計算方法具有一致性的評分結(jié)果。AHP 法與 CRITIC法權(quán)重系數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.4834，相關(guān)性不顯著（

P

＝0.6788），說明兩者反映的信息不具有疊加性。因此采用AHP-CRITIC 法計算綜合評分。

表6 3 種賦權(quán)法的綜合評分
Tab 6 Comprehensive scores of three empowerment methods

?試驗號AHPCRITICAHP-CRITIC 1 48.4956.5447.93 2 75.5675.9174.97 3 95.2789.5394.89 4 55.1359.7054.24 5 84.1380.0283.68 6 92.1695.9892.02 7 66.1166.7865.43 8 78.0782.3677.58 9 85.0387.6084.66

2.6 正交實驗

對AHP-CRITIC 法計算的綜合評分進行分析，直觀分析結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表7 直觀分析結(jié)果
Tab 7 Intuitive analysis

因素ABCD（誤差）k172.59755.86772.51072.090 k276.64778.74371.29077.473 k375.89090.52381.33375.570 R 4.05034.65610.043 5.383

表8 方差分析結(jié)果
Tab 8 Results of variance analysis

方差來源 偏差平方和 自由度FF 臨界值 顯著性A 27.8212 0.7676.940＞0.05 1863.195251.3746.940＜0.05 C 180.2082 4.9696.940＞0.05 D（誤差）72.532－－－B

由表7 可知各因素對實驗結(jié)果影響的大小，即提取次數(shù)（B）＞提取時間（C）＞加水量（A），直觀分析最佳工藝為ABC。方差分析結(jié)果顯示提取次數(shù)對綜合評分影響顯著（

P

＜0.05），加水量和提取時間對其無顯著性影響，綜合直觀分析、方差分析結(jié)果并考慮到后期實驗安排，最終確定提取工藝為ABC，即10倍水煎煮2.5 h，共提取3 次。

2.7 驗證優(yōu)化工藝

按處方量稱取適量丹參、三七，按照最佳工藝ABC進行實驗驗證，重復(fù)3 次，結(jié)果見表9。結(jié)果表示在最佳提取工藝下，丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體平均含量分別為6.0995、3.9546、0.2648 mg·g，

RSD

分別為0.95%、0.33%、1.6%，即正交設(shè)計優(yōu)選出的最佳工藝是可行的。

表9 工藝驗證實驗(mg·g)
Tab 9 Process verification test (mg·g)

實驗次數(shù)丹參素鈉人參皂苷Rg1總固體1 6.04503.94360.2630 2 6.09283.95130.2695 3 6.16083.96890.2619平均值6.09953.95460.2648 RSD/%0.950.331.6

2.8 丹參、三七醇沉調(diào)堿、水沉調(diào)酸的pH 條件優(yōu)化

中藥滴眼液應(yīng)按照中藥注射液的制備方法來制備，參考丹參注射液標準制備工藝中醇沉調(diào)堿至pH 為8 ～9，水沉調(diào)酸至pH 為2 ～3。本文研究調(diào)堿至pH ＝8.0、8.5、9.0，調(diào)酸至pH ＝2.0、2.5、3.0 時丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量的變化，實驗均在室溫（25 ℃）下進行，重復(fù)3 次，結(jié)果見表10。

由表10 可知pH 為8.0 時，丹參素鈉、人參皂苷Rg收率均＞100%，這可能是溶液中其他成分在此pH 下轉(zhuǎn)化而來，pH 從8.5 到9.0 變化時，丹參素鈉、人參皂苷Rg收率均略微升高，但總固體除去率有所降低，因此綜合考慮水煎液醇沉調(diào)堿可至8.0 ～8.5。當(dāng)pH 在2.0 ～3.0 變化時丹參素鈉收率和總固體除去率先升高后降低，但人參皂苷Rg收率一直在升高，pH ＝3.0時收率為92.48%，綜上考慮水煎液水沉調(diào)酸可至2.5 ～3.0。

表10 各種pH 下醇沉、水沉的結(jié)果(%)
Tab 10 Alcohol precipitation and water precipitation under various pH values (%)

pH丹參素鈉收率人參皂苷Rg1 收率總固體除去率8.0107.93111.9022.41 8.5 91.97 96.3327.04 9.0 92.81 98.9325.28 2.0 96.88 68.40 8.06 2.5100.24 79.70 9.15 3.0 97.07 92.48 7.22

3 討論

丹參-三七是常用的活血化瘀藥對，兩者功效相近，配伍后功效倍增，研究表明兩者合煎后能產(chǎn)生新的化合物，這也意味著兩者配伍并不是簡單的兩藥加和。目前，復(fù)方丹參方相關(guān)劑型中只有滴丸劑是由丹參、三七加水合煎制成，其他劑型均由丹參經(jīng)醇提、水提分步提取后與三七細粉或其醇提物混勻制成，本文考察丹參、三七合煎時的水提工藝旨在為后期開發(fā)復(fù)方丹參方相關(guān)劑型提供基礎(chǔ)。

中藥復(fù)方中多指標權(quán)重系數(shù)的確定十分重要，過去考慮到復(fù)方多具有“君臣佐使”的組方原則，大多會根據(jù)經(jīng)驗確定權(quán)重系數(shù)，多有主觀性，卻忽略了客觀數(shù)據(jù)信息的影響。本文采用了AHP-CRITIC 法計算綜合評分，可兼顧主客觀因素，得到的結(jié)果也更合理，更科學(xué)。

前期對水提方法和單因素實驗考察發(fā)現(xiàn)丹參素對提取溫度和時間要求較高，本文優(yōu)選出的最佳水提工藝也證明了這一點，這是因為丹參有效成分中含量最高的丹酚酸B 會在高溫下慢慢降解產(chǎn)生丹參素。而在實際生產(chǎn)中，考慮到耗能和成本問題，應(yīng)從藥材源頭開始把控，確定最佳提取pH 值、合理藥材二煎或三煎時間等，優(yōu)選出適合實際生產(chǎn)的最佳工藝。