楊濟(jì)齊,沈婉瑩,魏曉芳,杜文超,張景照,唐旭東,*(.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730000;2.深圳清華大學(xué)研究院創(chuàng)新中藥及天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 58000;3.廣東省創(chuàng)新中藥及天然藥物研究工程中心,廣東 深圳 58000)
陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata
Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮,具有理氣健脾,燥濕化痰等功效?,F(xiàn)代藥理與化學(xué)研究表明其含有黃酮類、揮發(fā)油等活性成分,具有抗腫瘤等作用,在中成藥和食品中應(yīng)用廣泛。陳皮以廣陳皮為道地,以新會(huì)為道地核心產(chǎn)區(qū)。受地域等條件限制,市面上流通的廣陳皮占比不大,摻假售假、以次充好問(wèn)題頻頻發(fā)生,在一定程度上制約了陳皮產(chǎn)業(yè)發(fā)展?;诩t外光譜三級(jí)鑒別法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)陳皮的快速、無(wú)損鑒別,本實(shí)驗(yàn)對(duì)14 批不同產(chǎn)區(qū)、不同儲(chǔ)存年限的陳皮進(jìn)行二維相關(guān)紅外光譜分析,為其鑒別和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。中藥粉碎機(jī)(拜杰BJ-800A),超聲儀(昆山美美超聲儀器有限公司),電熱套(海寧市新華醫(yī)療器械廠),水分測(cè)定管(北玻),高效液相色譜儀(Thermo),電子天平(瑞士Mettler-Toledo,精度:十萬(wàn)分之一),電子天平(Explorer,精度:十萬(wàn)分之一),Perkin Elmer FI-IR Spectrometer Frontier 傅里葉變換紅外光譜儀(配備DTGS 探測(cè)器,SYD TC-01 程序控制變溫附件,F(xiàn)W-4 型壓片機(jī),天津天光光學(xué)儀器有限公司)。
Citrus reticulata
‘Chachi’(廣陳皮);S9 ~S14 為網(wǎng)購(gòu)陳皮藥材。樣品具體信息見表1。表1 陳皮樣品信息
Tab 1 Citri reticulatae pericarpium sample information
編號(hào)產(chǎn)地年份來(lái)源S1廣東省江門市新會(huì)區(qū)雙水鎮(zhèn)2020基地S2廣東省江門市新會(huì)區(qū)雙水鎮(zhèn)2019基地S3廣東省江門市新會(huì)區(qū)雙水鎮(zhèn)2018基地S4廣東省江門市新會(huì)區(qū)天馬村2015基地S5廣東省江門市新會(huì)區(qū)天馬村2010基地S6廣東省江門市新會(huì)區(qū)梅江村2015藥材公司S7廣東省江門市開平市2020藥材公司S8廣西省2017藥材公司S9浙江省2019藥材公司S10浙江省2018藥材公司S11四川省2020藥材公司S12湖南省2018藥材公司S13湖北省2020藥材公司S14湖北省2018藥材公司
甲苯(廣州牌化學(xué)試劑),甲醇(分析純,西隴科學(xué)),甲醇(色譜純,avantor),溴化鉀(光譜級(jí),Alfa Aesar)。
陳皮對(duì)照藥材(批號(hào):120969-201510);橙皮苷(純度95.3%,批號(hào):110721-202019)、川陳皮素(純度99.7%,批號(hào):112055-202102)、橘皮素(純度99.7%,批號(hào):112054-202102)(對(duì)照品,中國(guó)食品藥品檢定研究院)。
精密稱定適量過(guò)二號(hào)篩陳皮粉末,參考2020年版《中國(guó)藥典》,按照通則0832 第四法甲苯法對(duì)各批次陳皮進(jìn)行水分測(cè)定,計(jì)算含水量(%)。結(jié)果14 批陳皮水分含量在6.49%~12.49%,均不超過(guò)13%,符合藥典規(guī)定。8 批廣陳皮藥材水分含量在6.49%~12.39%,另6 批陳皮藥材水分含量在8.22%~12.49%。
2.2.1 色譜條件 參照2020年版《中國(guó)藥典》廣陳皮高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定橙皮苷、川陳皮素、橘皮素含量。色譜條件:Agilent Eclipse XDB-C色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0 ~10 min,22%A,10 ~20 min,22%~48%A;20 ~35 min,48%A),柱溫25℃,流速1 mL·min,檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm(0 ~20 min)、330 nm(20 ~35 min),進(jìn)樣量5 μL。
2.2.2 混合對(duì)照品溶液 精密稱定對(duì)照品橙皮苷、川陳皮素、橘皮素適量置量瓶中,甲醇定容至10 mL,制成每1 mL 含橙皮苷0.2034 mg,川陳皮素25.0845 μg,橘皮素16.3348 μg 的混合對(duì)照品溶液。
2.2.3 供試品溶液 14 批陳皮經(jīng)粉碎后過(guò)二號(hào)篩,精密稱定0.2 g,精密加入25 mL 甲醇,超聲(功率300 W,頻率40 kHz)45 min,補(bǔ)重,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。
2.2.4 樣品含量 樣品測(cè)定結(jié)果見表2。8 批兩廣區(qū)域陳皮的橙皮苷含量在2.11%~6.93%,川陳皮素含量在0.21%~0.48%,橘皮素含量在0.23%~0.45%,3 種成分含量最高的均為2020年開平產(chǎn)區(qū)陳皮。另6 批陳皮的橙皮苷含量在5.27%~9.11%,川陳皮素含量在0.02%~0.70%,橘皮素含量在0.01%~0.58%。與非兩廣產(chǎn)區(qū)陳皮相比,兩廣產(chǎn)區(qū)陳皮的橙皮苷含量普遍較低,2019年浙江、2020年湖北產(chǎn)區(qū)陳皮所含川陳皮素、橘皮素含量很低。
表2 14 批陳皮含量測(cè)定結(jié)果
Tab 2 Content determination of 14 batches of citri reticulatae pericarpium
樣品編號(hào)橙皮苷/% 川陳皮素/% 橘皮素/%川陳皮素+橘皮素/%S14.310.280.260.54 S23.380.210.230.44 S33.010.230.260.49 S43.330.280.280.56 S52.830.380.320.70 S62.110.320.270.59 S76.930.480.450.93 S82.880.250.240.49 S97.520.020.010.03 S105.270.700.581.28 S119.110.350.210.56 S126.810.650.581.23 S137.100.070.060.13 S146.250.640.551.19
2.3.1 樣品制備 采用壓片法制備樣品:1 mg 樣品加入100 mg 光譜純溴化鉀(KBr)粉末,紅外燈照射下研磨均勻,壓片,加壓至18 ~20 MPa,維持壓力3 min。樣品過(guò)9 號(hào)篩、經(jīng)五氧化二磷真空干燥24 h,KBr 使用前經(jīng)120 ℃烘干,過(guò)200 目篩。
掃描范圍4000 ~400 cm,分辨率4 cm,掃描次數(shù)64 次,測(cè)譜方式為透射譜,扣除KBr背景,實(shí)時(shí)扣除水和CO的干擾。按照每分鐘2℃的升溫速度對(duì)其進(jìn)行加熱,30 ~120 ℃溫度內(nèi)每隔10 ℃測(cè)試一次,得到一系列紅外光譜。
2.3.2 方法學(xué)考察 取樣品S1,采集室溫下的紅外光譜圖。壓片后置干燥器中,每0、1、2、3、4、5 h 測(cè)定一次,所得紅外光譜圖基本一致,譜間相關(guān)系數(shù)分別為1.000、0.9986、0.9976、0.9976、0.9980、0.9964,RSD
為0.12%,結(jié)果表明儀器穩(wěn)定性良好。取樣品S1,連續(xù)掃描5 次,所得紅外光譜圖基本一致,譜間相關(guān)系數(shù)分別為1.000、0.9999、0.9998、0.9998、0.9997,RSD
為0.010%,結(jié)果表明儀器精密度良好。取樣品S1,采集室溫下紅外光譜圖,重復(fù)壓片5 次,所得紅外光譜圖基本一致,譜間相關(guān)系數(shù)分別為1.000、0.9958、0.9934、0.9815、0.9846,RSD
為0.79%,表明方法重復(fù)性良好。取陳皮對(duì)照藥材,制備樣品,經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得到陳皮對(duì)照藥材在1700 ~1396 cm波段、1150 ~996 cm波段的二維相關(guān)紅外光譜。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次,所得譜圖中相關(guān)峰位置及相對(duì)強(qiáng)度基本一致。結(jié)果表明該方法具有良好的重復(fù)性。
2.3.3 數(shù)據(jù)處理 譜圖經(jīng)基線校正、歸一化后,采用Spectrum 軟件的求導(dǎo)功能,13 點(diǎn)平滑,得紅外二階導(dǎo)數(shù)譜圖。二維相關(guān)紅外光譜圖采用清華大學(xué)自行設(shè)計(jì)的二維相關(guān)分析軟件進(jìn)行處理。譜間相關(guān)系數(shù)由紅外光譜儀Compare 功能計(jì)算得到。
2.3.4 紅外光譜解析 圖1 和圖2 為14 批陳皮樣品及相關(guān)對(duì)照藥材、對(duì)照品的紅外光譜圖。以廣東新會(huì)陳皮S1 樣品的紅外譜圖為參考,計(jì)算8批廣陳皮樣品譜間相關(guān)系數(shù);以陳皮對(duì)照藥材為參考,計(jì)算6 批陳皮樣品譜間相關(guān)系數(shù),見表3。
圖1 14 批陳皮樣品紅外光譜圖(4000 ~400 cm-1)Fig 1 Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)spectra of 14 batches of citri reticulatae pericarpium samples(4000 ~400 cm-1)
圖2 對(duì)照藥材及對(duì)照品紅外光譜圖(4000 ~400 cm-1)Fig 2 FTIR spectra of reference materials(4000 ~400 cm-1)
表3 譜間相關(guān)系數(shù)
Tab 3 Correlation coefficient between spectra
樣品譜間相關(guān)系數(shù)樣品譜間相關(guān)系數(shù)S11.0000 S90.8422 S20.9749 S100.9132 S30.9701 S110.9331 S40.9513 S120.9286 S50.9345 S130.8991 S60.9446 S140.8947 S70.9465陳皮對(duì)照藥材1.0000 S80.9333
8 批廣陳皮的紅外光譜圖在(3414±14)cm,(2927±2)cm,(1744±7)cm,(1640±9)cm,(1517±2)cm,(1443±2)cm,(1371±1)cm,(1268±6)cm,(1103±2)cm,(770±7)cm,(629±6)cm附近含有明顯特征峰。其中(3414±14)cm附近為O-H伸縮振動(dòng)峰,(2927±2)cm附近為C-H 伸縮振動(dòng)峰,(1443±2)cm,(1371±1)cm附近為C-H 彎曲振動(dòng)峰,(1744±7)cm,(1640±9)cm附近為C =O 伸縮振動(dòng)峰。
6 批陳皮樣品的紅外光譜圖與廣陳皮相差不大,在(3405±6)cm,(2924±4)cm,(1742±6)cm,(1638±11)cm,(1519±1)cm,(1443±1)cm,(1372±3)cm,(1276±1)cm,(1100±4)cm,(767±1)cm,(624±9)cm附近含有明顯特征峰。14 批樣品與陳皮對(duì)照藥材的紅外譜圖在3409 cm,2926 cm,1740 cm,1643 cm,1518 cm,1443 cm,1372 cm,1274 cm,1100 cm,774 cm,627 cm處對(duì)應(yīng);與川陳皮素對(duì)照品的紅外譜圖在1648 cm,1520 cm,1372 cm處對(duì)應(yīng);與橘皮素對(duì)照品的紅外譜圖在1514 cm,1266 cm,1075 cm,831 cm處對(duì)應(yīng)。各樣品在1074 cm或1053 cm附近,831 cm或815 cm附近存在吸收峰。
2.3.5 二階導(dǎo)數(shù)光譜解析 1750 ~ 1400 cm波段、1150 ~985 cm波段內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)譜圖(橫坐標(biāo)為波長(zhǎng),單位cm,縱坐標(biāo)為吸光度)見圖3 ~6。在1700 ~1450 cm,紅外譜圖上可以觀察到(1638±11)cm,(1518±2)cm兩個(gè)吸收峰,二階導(dǎo)數(shù)譜中可以觀察到的共有峰為(1649±3)cm,(1604±3)cm,(1519±2)cm,(1468±2)cm等4 個(gè)明顯的吸收峰。與陳皮對(duì)照藥材的二階導(dǎo)數(shù)光譜在1649 cm,1604 cm,1519 cm,1468 cm處對(duì)應(yīng);與川陳皮素對(duì)照品的二階導(dǎo)數(shù)光譜在1648 cm,1605 cm,1520 cm,1467 cm處對(duì)應(yīng);與橘皮素對(duì)照品的二階導(dǎo)數(shù)光譜在1652 cm,1609 cm,1514 cm處對(duì)應(yīng)。二階導(dǎo)數(shù)光譜提高了譜圖分辨率,與紅外光譜相比可以獲得更多的樣本信息。紅外光譜中,(1518±2)cm和(1443±2)cm間沒(méi)有吸收峰,而在二階導(dǎo)數(shù)光譜中,可以明顯地觀察到(1468±2)cm這個(gè)在紅外光譜中觀察不到的吸收峰。廣陳皮各處吸收峰強(qiáng)度弱于非兩廣地區(qū)陳皮,表明其在含量上可能存在差別。
圖3 14 批陳皮二階導(dǎo)數(shù)光譜(1750 ~1400 cm-1)Fig 3 Second derivative infrared spectra of 14 batches of citri reticulatae pericarpium(1750 ~1400 cm-1)
在1150 ~985 cm波段,二階導(dǎo)數(shù)光譜不僅可以觀察到(1078±2)cm,(1050±2)cm等吸收峰,還可以觀察到(1010±5)cm這個(gè)明顯的吸收峰。與川陳皮素對(duì)照品的二階導(dǎo)數(shù)光譜在1115 cm,1080 cm處對(duì)應(yīng);與橘皮素對(duì)照品的二階導(dǎo)數(shù)光譜在1111 cm,1075 cm處對(duì)應(yīng)。隨著年限增加,產(chǎn)自雙水鎮(zhèn)的陳皮在1107 cm處由單峰變?yōu)殡p峰。
圖4 對(duì)照藥材及對(duì)照品二階導(dǎo)數(shù)光譜(1750 ~1400 cm-1)Fig 4 Second derivative infrared spectra of the reference(1750 ~1400 cm-1)
圖5 14 批陳皮二階導(dǎo)數(shù)光譜(1150 ~985 cm-1)Fig 5 Second derivative infrared spectra of 14 batches of citri reticulatae pericarpium(1150 ~985 cm-1)
圖6 對(duì)照藥材及對(duì)照品二階導(dǎo)數(shù)光譜(1150 ~985 cm-1)Fig 6 Second derivative infrared spectra of reference (1150 ~985 cm-1)
2.3.6 二維相關(guān)紅外光譜解析 采用二維相關(guān)光譜對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、不同儲(chǔ)存年限陳皮藥材進(jìn)一步區(qū)分。圖7 為陳皮對(duì)照藥材及14 批樣品在1700 ~1396 cm波段內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。它們的相關(guān)峰在強(qiáng)度、位置、個(gè)數(shù)上存在差異。對(duì)照藥材含有5 個(gè)吸收峰,最強(qiáng)峰位置在1604 cm處。2020年陳皮:雙水產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1643 cm處,開平產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1603 cm處,四川、湖北產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1653 cm處。2019年陳皮:雙水產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1404 cm處,浙江產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1605 cm處。2018年陳皮:雙水產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1648 cm處,浙江、湖南產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1402 cm、1401 cm處。2017年廣西產(chǎn)陳皮在1403 cm,1511 cm,1605 cm,1649 cm處有4 個(gè)明顯的自動(dòng)峰,最強(qiáng)峰在1605 cm處。2015年天馬與梅江產(chǎn)陳皮對(duì)比結(jié)果表明:兩者最強(qiáng)峰位置大致相同,梅江產(chǎn)陳皮在1400 cm處相對(duì)峰強(qiáng)度略強(qiáng)于天馬產(chǎn)陳皮。根據(jù)這些差異,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)陳皮的快速鑒別。隨著儲(chǔ)存年限的增加,天馬產(chǎn)陳皮1595 cm處吸收峰增強(qiáng),1653 cm處吸收峰減弱。湖北產(chǎn)區(qū)1401 cm處吸收峰變強(qiáng),最強(qiáng)峰由1653 cm移至1605 cm處。浙江產(chǎn)最強(qiáng)峰位置由1605 cm移至1402 cm處。
圖7 陳皮對(duì)照藥材及14 批樣品二維相關(guān)紅外光譜(1396 ~1700 cm-1)Fig 7 2D-IR synchronous correlation spectra of the reference and 14 batches of citri reticulatae pericarpium(1396 ~1700 cm-1)
進(jìn)一步分析陳皮對(duì)照藥材及14 批樣品1150 ~996 cm波段二維相關(guān)紅外光譜,如圖8所示。在該范圍內(nèi),不同產(chǎn)區(qū)陳皮自動(dòng)峰、最強(qiáng)峰的位置及峰的相對(duì)強(qiáng)度有所差異。對(duì)照藥材含有5 個(gè)吸收峰,最強(qiáng)峰位置在1001 cm處。廣陳皮的二維相關(guān)譜圖形成非常明顯的4×4 矩陣,含有5 個(gè)自動(dòng)峰。2020年陳皮:雙水、四川產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1094 cm、1092 cm處,開平產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1004 cm處,湖北產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在998 cm處。2019年陳皮:雙水產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1042 cm處,浙江產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1090 cm處。2018年陳皮:雙水產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1042 cm處,浙江、湖南產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1090 cm、1092 cm處。2017年廣西產(chǎn)陳皮在1002 cm,1044 cm,1066 cm,1092 cm,1133 cm處有5 個(gè)明顯的自動(dòng)峰,最強(qiáng)峰在1044 cm處。2015年天馬與梅江產(chǎn)區(qū)陳皮對(duì)比結(jié)果表明:天馬產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1002 cm處,梅江產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰位置在1044 cm處。隨著年限增加,雙水產(chǎn)陳皮最強(qiáng)相關(guān)峰由1094 cm處移至1042 cm處。天馬產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰由1002 cm移至1092 cm處。湖北產(chǎn)陳皮最強(qiáng)峰由998 cm移至1092 cm處。直觀上,S1 ~S8(廣東、廣西產(chǎn)陳皮)譜圖較為相似,S9、S10、S12、S14 譜圖較為相似,S11、S13 譜圖較為相似。
圖8 陳皮對(duì)照藥材及14 批樣品二維相關(guān)紅外光譜(1150 ~996 cm-1)Fig 8 2D-IR synchronous correlation spectra of the reference and 14 batches of citri reticulatae pericarpium(1150 ~996 cm-1)
本研究結(jié)果表明14 批樣品的水分及含量測(cè)定均符合藥典要求,廣陳皮中橙皮苷含量普遍低于陳皮。對(duì)于陳皮和廣陳皮藥材,《中國(guó)藥典》在含量測(cè)定項(xiàng)下的規(guī)定也有所不同:陳皮要求橙皮苷含量不低于3.5%,廣陳皮要求橙皮苷含量不得少于2.0%,且川陳皮素與橘皮素的總量不得少于0.42%。說(shuō)明藥材的道地性并不通過(guò)單一指標(biāo)性化學(xué)成分來(lái)評(píng)價(jià)。僅對(duì)現(xiàn)有一種或幾種化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定,缺乏可信度,所得結(jié)果也難以闡明中藥道地性。后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥效學(xué)研究,分析基于中藥成分出發(fā)的化學(xué)評(píng)價(jià)與藥效評(píng)價(jià)結(jié)果間的異同點(diǎn)。
本文對(duì)14 批不同產(chǎn)區(qū)、不同年限陳皮水分、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素含量進(jìn)行對(duì)比分析,并對(duì)它們的二維相關(guān)紅外光譜進(jìn)行了整體解析。與紅外光譜相比,二階導(dǎo)數(shù)光譜可以獲得更多的樣本信息,能夠觀察到(1468±2)cm、(1010±5)cm等吸收峰。1700 ~1396 cm波段、1150 ~996 cm波段的二維相關(guān)紅外光譜結(jié)果表明,自動(dòng)峰的相對(duì)強(qiáng)度和最強(qiáng)峰位置可作為陳皮快速鑒別的依據(jù):1700 ~1396 cm波段,2020年四川、2020年湖北產(chǎn)陳皮只含有2個(gè)相關(guān)峰,廣陳皮則含有4 或5 個(gè)相關(guān)峰。由于相對(duì)強(qiáng)度及最強(qiáng)峰位置的不同,2018年浙江與2018年湖南產(chǎn)陳皮的二維譜圖在直觀上與廣陳皮有明顯區(qū)別,2019年浙江、2018年湖北產(chǎn)陳皮二維圖譜與廣陳皮較為相似。1150 ~996 cm波段,廣陳皮的二維相關(guān)譜圖形成非常明顯的4×4 矩陣。2020年四川、2020年湖北產(chǎn)區(qū)陳皮可以被直觀有效區(qū)分開來(lái),2019年浙江、2018年浙江、2018年湖南、2018年湖北產(chǎn)陳皮則在(1090±1)cm及1044 cm處峰較強(qiáng),在(1003±1)cm及1060 cm處峰較弱,與廣陳皮的二維譜圖相比差異較大。
色譜、質(zhì)譜等鑒別方法具有預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程煩瑣、耗時(shí)耗材的缺點(diǎn),建立一種快速、無(wú)損、便捷的鑒別手段是亟需解決的問(wèn)題。已經(jīng)有許多學(xué)者將二維相關(guān)紅外光譜用于不同產(chǎn)區(qū)中藥材的鑒別研究,該方法直接對(duì)中藥粉末進(jìn)行測(cè)定,既可以反映樣品整體信息,又具有耗時(shí)短、耗材少的優(yōu)點(diǎn)。以往的研究多數(shù)僅對(duì)新會(huì)陳皮與其他產(chǎn)區(qū)陳皮進(jìn)行鑒別區(qū)分,而本文還聚焦了新會(huì)內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)(雙水、天馬、梅江等地)陳皮的比較研究,更加細(xì)化、具體。二維相關(guān)紅外光譜法可以為陳皮的品質(zhì)評(píng)價(jià)、鑒別、質(zhì)量控制提供參考。在后續(xù)研究中,本課題組將通過(guò)細(xì)胞篩選平臺(tái)對(duì)上述樣品進(jìn)行功能層面的驗(yàn)證,以期從化學(xué)組成和生物學(xué)功能多方面探討樣本的差異。