孫苗苗，梁鵬晨，周紫艷，唐曄翎，李田，梁冬雨，易清清*，常慶*（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海 0010；.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院臨床科研中心，上海 01800；.中國藥科大學(xué)研究生院，南京 11198）

骨質(zhì)疏松是一種骨骼密度和質(zhì)量降低的骨相關(guān)性疾病，患有骨質(zhì)疏松的患者，骨折的風(fēng)險會顯著增加。骨質(zhì)疏松癥已成為世界范圍內(nèi)最常見和治療昂貴的疾病之一。盡管目前使用二膦酸鹽可以降低骨質(zhì)疏松癥患者的骨折風(fēng)險，但其起效較慢，需要較長的治療周期，且具有一定的風(fēng)險，如胃腸道不耐受和頜骨壞死。而傳統(tǒng)的中藥具有不良反應(yīng)少，價格低等特點，在治療骨質(zhì)疏松方面具有較好的研究價值。

銀杏作為我國現(xiàn)存最早的孑遺植物，被稱為“活化石”，目前被廣泛用于治療多種疾病。據(jù)報道，該植物的主要化合物為萜類化合物、銀杏酸以及植物雌激素。銀杏葉的提取物具有抗氧化，調(diào)節(jié)血管舒縮以及改善血液循環(huán)，防止組織缺血等多種功能，被廣泛用于心血管疾病等方面。同時銀杏葉還有治療骨相關(guān)疾病的報道。研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可以改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠的堿性磷酸酶和骨礦物質(zhì)密度。但是銀杏葉作為一種傳統(tǒng)中藥，成分復(fù)雜，發(fā)揮藥效的成分不明確，因此明確銀杏葉中促成骨作用活性成分具有重要意義。目前利用生物信息方法研究中藥對疾病的作用機制比較成熟，因此本研究通過生物信息學(xué)對銀杏葉中促成骨活性的成分進行篩選，同時初步探討銀杏葉在促成骨方面的作用機制。

1 方法

1.1 有效成分的篩選

通過TCMSP（中草藥系統(tǒng)藥理平臺，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology）數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索銀杏葉的化合物。本研究以藥物相似度（DL）≥0.18為標準，并且排除沒有CID（數(shù)字標識）號以及沒有3D 結(jié)構(gòu)的化合物，剩余的成分即為銀杏葉中用于后續(xù)研究的促成骨活性成分。

1.2 分子對接

首先通過文獻閱讀查找骨相關(guān)蛋白，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、轉(zhuǎn)化生長因子-

β

激活激酶1（transforming growth factor-beta activated kinase 1，TAK1）、蛋白酪氨酸激酶-2

β

（protein tyrosine kinase-2 beta）， 利 用PDB（https：//www.rcsb.org）下載蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，采用 AutoDock Tools軟件對刪除水分子、添加氫原子、分離原配體，輸出蛋白并保存為pdbqt 格式。從Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載相應(yīng)化合物的3D 結(jié)構(gòu)文件，并轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式。將蛋白中原配體的位置坐標，設(shè)置為對接的活性位點。利用Autodock Vina 軟件，進行分子對接及結(jié)合自由能評價。促成骨相關(guān)蛋白信息見表1。

表1 促成骨相關(guān)蛋白信息
Tab 1 Promoting bone-related protein information

信號通路蛋白UniprotPDB 編號原配體MAPKERK1 ERK2 TAK1 38Z 36Q EDH BMPAKT1 AKT2 P27361 P28482 O43318 4QTB 4QP3 5V5N SMH G95其他Protein tyrosine kinase-2 beta P31749 P31751 3QKK 3E87 Q142893ET7349

1.3 化合物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）的預(yù)測及篩選

藥物與人體之間的相互作用是一個雙向過程：藥物影響人體，導(dǎo)致受體抑制，激活和信號通路阻斷，人體通過ADME 來處置藥物，所以研究藥物的ADME 性質(zhì)對研究藥理活性具有重要意義。本文選取對接分數(shù)排名前20 的化合物進行ADME 的預(yù)測。將這些化合物3D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Discover studio（2016）中ADMET 板塊，在“small molecules（小分子）”模塊中選定“calculate molecular properties（計算分子性質(zhì)）”點擊 “ADMET descriptors” 進行參數(shù)設(shè)置，點擊運行，對化合物的ADME 進行預(yù)測，獲得這些化合物的被動腸內(nèi)吸收性、25 ℃ 以下的水溶性、人細胞色素 P450 2D6 酶結(jié)合（CYP2D6 binding）、肝毒性、血漿蛋白結(jié)合等方面的數(shù)據(jù)。

1.4 毒性預(yù)測

本研究將對接結(jié)果得分之和排名前20 的化合物放在Discover studio 軟件中TOPKAT 板塊進行毒性預(yù)測，在“small molecules”模塊中選定“calculate molecular properties”點擊 TOPKAT descriptors（毒性描述）進行參數(shù)設(shè)置，點擊運行，分析結(jié)果。

1.5 體外成骨活性評價

MC3T3-E1 細胞（小鼠胚胎成骨前體細胞）用含 10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基（含100 IU·mL青霉素、100 μg·mL鏈霉素），在37 ℃、5%CO、飽和濕度條件下培養(yǎng)至細胞生長至 70%～80%開始傳代，進行后續(xù)實驗。調(diào)整細胞濃度為5×10個·mL，每孔體積100μL，接種于96 孔中24 h 后，分成7 組分別給予藥物干預(yù)，分別為對照組（含有5%血清的MEM培養(yǎng)基），二甲基亞砜（DMSO）組，藥物組（2.30、4.61、13.87、9.23、18.46 mol·L胡蘿卜苷），每組3 個復(fù)孔，放入37℃培養(yǎng)24 h 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育1 h，在450 nm 波長下用酶標儀測定每孔吸光度（

OD

）值。

1.6 實時定量PCR（qRT-PCR）

實時定量PCR 檢測TAK1、AKT1 mRNA 相對表達量。

不同濃度的胡蘿卜苷（0、2.30，4.61 mol·L）處理MC3T3-E1 細胞3 d，使用Trizol、氯仿、乙醇及DEPC 水等抽提總RNA，所有的操作均在冰上進行，然后根據(jù)試劑說明書進行RNA 的逆轉(zhuǎn)錄過程。37℃，15 min，85℃ 5 s 進行逆轉(zhuǎn)錄。擴增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性3 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)，以GAPDH 為內(nèi)參，目的基因相對表達量采用2法。引物序列見表2。

表2 qRT-PCR 引物擴增序列
Tab 2 Amplification of gene primers by real-time quantitative PCR

基因名稱引物序列（5-3'）產(chǎn)物大小/bp TAK1 上游ATTCCACAGATACCAATGGCTC22下游TGTAGTAACAATGCGATTTCGG AKT1 上游CCGGAATTCAGCGACGTGGCTATTGTGA 28下游CCGCTCGAGGGCCGTGCGCTGGCCGAG GAPDH 上游CCTCGTCCCGTAGACAAAAATG21下游TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉中的有效成分篩選結(jié)果

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索銀杏葉中的有效成分，共獲取307 個成分，通過DL ≥0.18 為標準，篩選后獲得木犀草素-4'-葡萄糖苷，山柰酚-7-鼠李糖苷，沒食子兒茶素等86 個有效成分，排除沒有CID 號的化合物之后剩余72 個化合物，再排除有3D 結(jié)構(gòu)的化合物，剩余55 個化合物（見表3，用于后續(xù)的研究）。

表3 銀杏葉篩選后的主要活性成分
Tab 3 Main active ingredients of ginkgo biloba after screening

Mol ID化合物英文名稱化合物中文名稱相對分子量 DL MOL011597 luteolin-4'-glucoside木犀草素-4'-葡萄糖苷448.410.79 MOL008436 kaempferol-7-rhamnoside山柰酚-7-鼠李糖苷432.410.73 MOL011584 （－）-gallocatechin沒食子兒茶素594.560.61 MOL011580 chrysoeriol 7-glucoside大黃素-7-葡萄糖苷462.440.82 MOL002035 kaempferol 7-O-glucoside山柰酚7-O-葡萄糖苷448.410.76 MOL002692 5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-3-[（2S，3S，4S，5S，6R）-3，4，5-trihydroxy-6-（hydroxymethyl）tetrahydropyran-2-yl]oxy-chromen-4-one 5，7-二羥基-2-（4-羥基苯基）-3-[（2S，3S，4S，5S，6R）-3，4，5-三羥基-6-（羥甲基）四氫吡喃-2-基]氧基色-4-酮448.410.74 MOL000357 daucosterol胡蘿卜苷576.950.62 MOL003686 narcissoside水仙苷624.60.65 MOL007179 linolenic acid ethyl ester亞麻酸乙酯306.540.2 MOL010972 quercitrin-2'-gallate槲皮苷-2'-沒食子酸酯600.520.68 MOL011569 5-methoxy-bilobetin5-甲氧基-膽堿582.540.6 MOL002693 nicotiflorin煙堿594.570.73 MOL007260 isorhamnetin-3-O-glucoside異鼠李素-3-O-葡萄糖苷478.440.8 MOL002511 isoginkgetin異豆角蛋白566.540.58 MOL011052 anacardic acid C羽扇豆酸C344.540.32 MOL008906 hydroginkgolinic acid氫化銀杏酸334.550.27 MOL004362 afzelin山柰酚3-鼠李糖苷432.410.7 MOL004401 bilobetin膽紅素552.510.63 MOL009278 laricitrin大黃素332.280.34 MOL011604 syringetin丁香脂素346.310.37 MOL011051 ginkgoic acid銀杏酸346.560.32 MOL011585 cardanol monoene腰果酚單烯302.550.21 MOL011054 5-（8Z-pentadecenyl）resorcinol5-（8Z-十五碳烯基）間苯二酚318.550.24 MOL002083 5，7，4'-trihydroxy-3'，5'-dimethoxyflavone5，7，4'-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮330.310.34 MOL009292 tricetin甘油三酸酯302.250.28 MOL011550 amentoflavone-7，4'，4'''-trimethyl ether黃酮7，4'，4'''-三甲基醚580.570.54 MOL002008 myricetin楊梅素318.250.31 MOL000354 isorhamnetin異鼠李素316.280.31 MOL005573 4'，5-dihydroxy-7-methoxyflavone4'，5-二羥基-7-甲氧基黃酮284.280.24 MOL002881 luteolin 4'-methyl ether木犀草素4'-甲基醚300.280.27 MOL002037 amentoflavone黃酮538.480.65 MOL002680 flavoxanthin毛莨黃素584.960.56 MOL000422 kaempferol山柰酚286.250.24 MOL000415 rutin蕓香苷610.570.68 MOL000437 hirsutrin頭孢菌素464.410.77 MOL000449 stigmasterol豆甾醇412.770.76 MOL000007 apigenin 7-glucoside芹菜素7-葡萄糖苷432.410.74 MOL003044 chryseriol金絲桃醇300.280.27 MOL000701 quercitrin槲皮苷448.410.74 MOL000006 luteolin木犀草素286.250.25 MOL000008 apigenin芹菜素270.250.21 MOL000098 quercetin槲皮素302.250.28 MOL002509 ginkgetin銀杏素566.540.59 MOL001955 chlorogenic acid綠原酸354.340.33 MOL000358 beta-sitosterolβ-谷甾醇414.790.75 MOL005043 campesterol菜油甾醇400.760.71 MOL011050 anacardic acid沒食子酸348.580.31 MOL011062 6-tridecylsalicylic acid6-十三烷基水楊酸320.520.23 MOL000096 （－）-catechin（－）-兒茶素290.290.24 MOL006791 epigallocatechin表沒食子兒茶素306.290.27 MOL008317 hydroginkgol氫化甘油304.570.21 MOL002249 gallocatechin兒茶素306.290.27

續(xù)表3

Mol ID化合物英文名稱化合物中文名稱相對分子量 DL MOL005805 pyreneβ-芘202.260.19 MOL002681 fluoranthene熒蒽202.260.18 MOL000492 （＋）-catechin（＋）-兒茶素290.290.24

2.2 分子對接結(jié)果分析

經(jīng)過文獻搜索最終選取ERK1，ERK2，TAK1，AKT1，AKT2、Protein tyrosine kinase-2 beta 六種成骨蛋白作為主要靶點，將從銀杏葉中篩選出來的木犀草素4'-葡萄糖苷，山柰酚7-鼠李糖苷等55 個有效成分與上述6 種成骨相關(guān)蛋白進行對接，每個分值與原配的相對得分越小，說明化合物與蛋白對接的穩(wěn)定性越好。從圖1、2 可以看到對接成功及結(jié)果較好的有黃酮（5281600），銀杏素（5271805）等53 個化合物。這些化合物中有些在骨研究方面有報道。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過調(diào)節(jié)有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號通路來減輕卵巢切除大鼠的骨質(zhì)疏松；山柰酚可以通過調(diào)節(jié)雌激素受體、BMP-2 等信號通路來實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的作用。圖1 選取了其中一個蛋白中對接分數(shù)較好的前幾個化合物進行展示。通過圖1 說明，銀杏葉中的化學(xué)成分的確含有跟骨相關(guān)蛋白對接的化合物，進一步來證實存在成骨的活性成分。

圖1 分子-蛋白殘基作用力示圖Fig 1 Molecule-protein residue force diagram

2.3 ADME 結(jié)果分析

本研究利用DS2016 對化合物進行ADME的預(yù)測，結(jié)果見表4。從表中可以看到水溶性較好的化合物為大黃素-7-葡萄糖苷（11294177），芹菜素-7-葡萄糖苷（5280704），木犀草素-4'-葡萄糖苷（26235513），山柰酚7-

O

-葡萄糖苷（10095180）等六種糖苷類化合物；腸內(nèi)吸收性較好的是

β

-芘（31423），芝麻素（72307）；可作為人細胞色素P450 2D6 酶結(jié)合（CYP2D6 binding）的非抑制劑5-甲氧基-膽堿（5319411），黃酮（5281600），

β

-芘（31423），芝麻素（72307）；沒有肝毒性的是木犀草素-4

'

-葡萄糖苷（26235513），

β

-谷甾醇（222284），菜油甾醇（173183），豆甾醇（5280794），胡蘿卜苷（5742590）等。

表4 銀杏葉中有效成分ADME 預(yù)測結(jié)果
Tab 4 ADME prediction results of selected components in ginkgo biloba

血漿蛋白結(jié)合11294177 chrysoeriol 7-glucoside大黃素-7-葡萄糖苷好不確定抑制劑非常不好 有毒強5280704 apigenin 7-glucoside芹菜素-7-葡萄糖苷好不確定抑制劑非常不好 有毒強26235513 luteolin-4'-glucoside木犀草素-4'-葡萄糖苷好不確定抑制劑非常不好 無毒強222284beta-sitosterolβ-谷甾醇極低 不確定抑制劑非常不好 無毒弱10095180 kaempferol 7-O-glucoside山柰酚-7-O-葡萄糖苷好不確定抑制劑非常不好 有毒強5319411 5-methoxy-bilobetin5-甲氧基-膽堿很低 不確定非抑制劑非常不好 有毒弱25079965 kaempferol-7-rhamnoside山柰酚-7-鼠李糖苷好不確定抑制劑非常不好 有毒強5280459 quercitrin槲皮苷好不確定抑制劑非常不好 有毒強5281696 amentoflavone-7，4'，4'''-trimethyl ether 黃酮7，4'，4'''-三甲基醚 很低 不確定抑制劑不好有毒弱173183campesterol菜油甾醇很低 不確定抑制劑非常不好 無毒弱5280794 stigmasterol豆甾醇很低 不確定抑制劑非常不好 無毒弱5318569 isoginkgetin異豆角蛋白很低 不確定抑制劑非常不好 有毒弱5271805 ginkgetin銀杏素很低 不確定抑制劑非常不好 有毒弱5281600 amentoflavone黃酮很低 不確定非抑制劑非常不好 有毒強5318767 nicotiflorin煙堿低不確定抑制劑非常不好 有毒強31423pyreneβ-芘很低 極高的滲透性非抑制劑好有毒弱5280805 rutin蕓香苷很低 不確定抑制劑非常不好 有毒強5742590 daucosterol胡蘿卜苷低不確定抑制劑不好無毒強72307sesamin芝麻素低中等抑制劑好有毒弱化合物化合物英文名稱化合物中文名稱水溶性水平血腦屏障水平細胞色素P450 2D6 水平人體腸道吸收水平肝毒性

圖2 分子對接相對得分熱圖Fig 2 Relative score heat map of molecular docking

2.4 毒性預(yù)測結(jié)果

對分子對接排名前20 的化合物進行毒性預(yù)測，結(jié)果見表5，可知豆甾醇（5280794）和胡蘿卜苷（5742590）相對于其他成分具有較低的致突變性、嚙齒動物致癌性和發(fā)育毒性潛力以及大鼠口服利用度較好。其中胡蘿卜苷的毒性最小，說明其在藥物的應(yīng)用方面具有較好的潛力。盡管胡蘿卜苷的水溶性較差，現(xiàn)如今隨著生物材料作為藥物載體的發(fā)展，選擇合適的藥物載體將有利于改善藥物溶解性差等問題。故結(jié)合ADME 的結(jié)果，選擇胡蘿卜苷進行后續(xù)實驗。

表5 銀杏葉中有效成分毒性預(yù)測結(jié)果
Tab 5 Toxicity prediction of selected components in ginkgo biloba

注：1.＜0.3（無致突變性），＞0.7（致突變）；2.＜0.3（非致癌物）， ＞0.7（致癌物）；3.＜50 mg·kg（高毒性），50 mg·kg ＜ ＜500 mg·kg（中等毒性），0.5 g·kg ＜ ＜5 g·kg（低毒性），5 g·kg ＜ ＜15 g·kg（實際上無毒性），＞15 g·kg（無毒性）；4.＜0.3（無毒）；＞0.7（有毒）。
Note：1.＜0.3（non-carcinogen），＞0.7（carcinogen）；2.＜0.3（non-mutagen），＞0.7（mutagen）；3.＜50 mg·kg（high toxicity），50 mg·kg ＜ ＜500 mg·kg（moderate toxicity），0.5 g·kg ＜ ＜5 g·kg（low toxicity），5 g·kg ＜ ＜15 g·kg（actually，non-toxic），＞15 g·kg（non-toxic）；4.＜0.3（non-toxic），＞0.7（toxic）.

化合物CID致突變1致癌性小白鼠2 致癌性大鼠2 大鼠口服利用度3/（g·kg－1）發(fā)育毒性4雄性雌性雄性 雌性11294177 0.901 1.000 0.979 0.966 0.0021.200 1.000 5280704 0.167 1.000 0.414 0.070 0.0001.500 1.000 26235513 0.927 1.000 0.473 0.087 0.0002.200 1.000 2222840.000 0.014 0.000 0.000 1.000333.200 0.966 10095180 1.000 0.000 0.164 1.000 0.075569.900 1.000 5319411 0.000 1.000 0.998 1.000 0.000338.200 1.000 25079965 0.998 1.000 0.023 0.416 0.00093.900 1.000 5280459 1.000 1.000 0.064 0.388 0.000113.700 1.000 5281696 0.000 1.000 0.893 1.000 0.000149.500 1.000 1731830.000 0.000 1.000 0.038 0.000321.500 0.961 5280794 0.000 0.000 1.000 0.012 0.000149.300 0.000 5318569 0.000 1.000 0.998 1.000 0.000262.800 1.000 5271805 0.000 1.000 0.999 1.000 0.000264.200 1.000 5281600 0.000 1.000 0.914 1.000 0.000627.200 1.000 5318767 1.000 1.000 0.0060.110 0.999174.700 1.000 314230.023 0.000 0.999 0.058 1.0002.900 0.966 5280805 1.000 1.000 0.009 0.138 1.000228.500 1.000 5742590 0.000 0.000 1.000 0.000 0.000358.600 0.010 723070.000 1.000 0.868 0.000 1.00015.600 0.888 5315459 0.000 1.000 1.000 1.000 0.000459.100 1.000

2.5 胡蘿卜苷與蛋白對接結(jié)果

胡蘿卜苷與蛋白受體具有較好的對接活性。與AKT2 蛋白對接自由能－10 kcal·mol，AKT1蛋白對接自由能－9.4 kcal·mol，Protein tyrosine kinase-2 beta 蛋白對接自由能－9 kcal·mol，EPK2 蛋白對接自由能－7.9 kcal·mol，EPK1 蛋白對接自由能－9.5 kcal·mol，TAK1 蛋白對接自由能－7.7 kcal·mol。經(jīng)過對接筆者發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷與這些蛋白的結(jié)合自由能小于－7 kcal·mol，可能具有較好的促成骨活性，胡蘿卜苷與受體AKT2 蛋白和ERK1 蛋白對接示意圖見圖3、4。

圖3 胡蘿卜苷和AKT2 蛋白分子對接示意圖Fig 3 Molecular docking of daucosterol and AKT2 protein

圖4 胡蘿卜苷和 ERK1 蛋白分子對接示意圖Fig 4 Molecular docking of daucosterol and ERK1 protein

2.6 體外成骨活性的檢測

如圖5結(jié)果顯示，成骨細胞培養(yǎng)細胞24 h 后，胡蘿卜苷在2.30 mol·L時， 對MC3T3-E1細胞具有明顯的促進作用（

P

＜0.0001），在4.61 mol·L時具有增殖效果（

P

＜0.05），在13.87 ～18.46 mol·L時對成骨細胞具有增殖趨勢。

圖5 胡蘿卜苷對成骨MC3T3-E1 細胞增殖的影響Fig 5 Effect of daucosterol on the proliferation of osteoblast MC3T3-E1 cells

2.7 胡蘿卜苷對TAK1、AKT1 mRNA 表達水平的影響

與對照組相比，胡蘿卜苷在4.61 mol·L時對TAK1、AKT1 mRNA 表達量有顯著的促進作用（

P

＜0.05），如圖6 所示。該實驗驗證了分子對接時胡蘿卜苷通過MAPK 信號通路和BMP信號通路促成骨的作用機制。

圖6 胡蘿卜苷促進TAK1、AKT1 mRNA 的表達Fig 6 Effect of daucosterol on the expression of TAK1 and AKT1 mRNA

3 討論

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）對銀杏葉中的成分進行了篩選，共獲得86 種有效成分。選取骨質(zhì)疏松相關(guān)MAPK信號通路中的蛋ERK1、ERK2、TAK1 和BMPs信號通路蛋白AKT1、AKT2、以及其他通路上的蛋白Protein tyrosine kinase-2 beta 蛋白。其中絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）是一種絲氨酸蛋白激酶，三個主要家族是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）家族，p38 激酶家族和c-Jun N 末端激酶（JNK）家族，每個家族都由各自的亞家族組成，參與多種細胞活動相關(guān)的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，可響應(yīng)各種刺激（包括激素、化學(xué)物質(zhì)和壓力），將信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞核，參與細胞增殖、存活、分化。據(jù)報道，有研究成骨細胞的基因表達和功能與MAPK 信號的刺激有關(guān)，并且有研究發(fā)現(xiàn)MSC來源的外來體通過MAPK 途徑促進成骨細胞的增殖而改善骨質(zhì)疏松癥。此外與骨質(zhì)疏松相關(guān)的信號通路BMP 骨形態(tài)發(fā)生蛋白可以與一些成骨轉(zhuǎn)錄因子，例如Dlx3，Dlx5 和Runx2相互作用，從而對促進間充質(zhì)干細胞對成骨細胞產(chǎn)生影響，并且指導(dǎo)它們分化為成骨細胞。其中BMP-2（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）刺激的成骨細胞分化需要胰島素樣生長因子（IGF）激活途徑的持續(xù)信號傳遞，而AKT2是IGF調(diào)節(jié)成骨的關(guān)鍵介質(zhì)。AKT 是成骨細胞中可以控制成骨細胞和破骨細胞分化的獨特信號傳導(dǎo)中間產(chǎn)物，在沒有AKT1的情況下減少成骨細胞的生長。本文選取MAPK 信號通路中的蛋白ERK1、ERK2、TAK1、BMP 信號通路上的蛋白AKT1、AKT2、以及其他通路上的蛋白Protein tyrosine kinase-2 beta 蛋白進行分子對接，并且我們選取其中的一個蛋白ERK1 與化合物槲皮素、豆甾醇、黃酮、胡蘿卜苷對接進行了展示。從分子對接的結(jié)果可知，成骨蛋白ERK1 與槲皮素作用力為疏水作用和氫鍵，其中相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點是Asp184（B），ERK1 與豆甾醇作用力為疏水作用和氫鍵。ERK1與黃酮為疏水作用和氫鍵，其中相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點是Lys71（B），Ser170（B）。ERK1 和胡蘿卜苷受體結(jié)合的作用力為疏水作用和氫鍵，其中相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點是As p166（B），Vac205（B），Arg84（B）。

通過ADME 毒性實驗、qRT-PCR 評價所選化合物的藥理性質(zhì)。在藥物研究中，其溶解度至關(guān)重要，藥物只有先溶于水才能通過吸收進入生物膜，并且藥物的溶解性影響藥物的藥理和毒性。藥物毒性在藥物臨床應(yīng)用方面具有非常重要的作用，低毒性的藥物能夠保證在應(yīng)用方面的安全性，提高藥物在臨床上的成功率。本研究對化合物毒性進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷相對于其他的化合物具有較低的毒性，并且大鼠口服利用度較好。盡管水溶性較差，但作為一種親脂性分子，更容易通過細胞膜進行吸收。此外胡蘿卜苷通過血腦屏障能力還不確定，有待進一步研究。在本課題組中主要是研究藥物載體，胡蘿卜苷低毒性的優(yōu)點，使我們將目標放在了胡蘿卜苷上，因此，通過實驗進一步來研究胡蘿卜苷的成骨能力，為后續(xù)課題組的研究提供了新的方向。通過體外實驗進一步驗證，銀杏葉中胡蘿卜苷具有促成骨的活性，并且作用機制為促進MAPK 信號通路中TAK1 mRNA 的表達和BMP 信號通路中AKT1 mRNA 的表達。

4 結(jié)論

本文利用生物信息學(xué)的方法對銀杏葉中的促成骨活性成分進行篩選，通過進一步對這些活性成分進行分子對接，ADME、毒性預(yù)測以及相關(guān)的實驗驗證，最終發(fā)現(xiàn)銀杏葉中的胡蘿卜苷具有較好的促成骨活性。更好地挖掘了銀杏葉中的有效成分在治療骨疾病方面的潛力，也為在治療骨疾病方面提供了一種新的中藥單體，為后續(xù)研究銀杏葉在促成骨方面的機制方面提供了新的選擇，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥單體的作用，進一步促進中醫(yī)藥的發(fā)展。