趙媛媛，任一冉，劉兆薇，劉潔，劉珍清*，劉穎，3*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0009；.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 0009；3.北京市科委中藥生產(chǎn)過程控制與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 0009）

苦碟子，來源于菊科植物抱莖苦荬菜

Ixeris sonchifolia

（Bunge）Hance 的全草，又名苦荬菜、滿天星，為多年生草本植物，產(chǎn)于我國(guó)東北、華北等地。據(jù)《內(nèi)蒙古中草藥》記載，苦碟子味苦、性寒，具有清熱解毒、涼血、活血、排膿之功效?？嗟雍卸喾N類型化學(xué)成分，主要活性成分為核苷類（腺苷等）、有機(jī)酸類（綠原酸、阿魏酸等）、黃酮類（芹菜素、木犀草素等）、倍半萜內(nèi)酯類（Ixerin Z、Sonchifoliasolide B 等）以及三萜類（抱莖苦荬菜皂苷、齊墩果酸等）化合物等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，苦碟子具有增加腦血流量、增加冠脈血流量、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗病毒、抗腫瘤、保肝、調(diào)節(jié)血脂代謝等多種藥理活性。目前，以其水提物制備的苦碟子注射液在臨床上被廣泛用于治療腦梗死、冠心病、肺源性心臟病、腦出血、糖尿病及其并發(fā)癥等，且其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究相對(duì)清晰和深入。而有研究表明，活性成分在苦碟子醇提物中含量更高，且研究者發(fā)現(xiàn)苦碟子醇提物中分離出的三萜皂苷類和倍半萜內(nèi)酯類化合物具有良好的抗腫瘤活性，其黃酮和木脂素類化合物有成為天然抗氧化劑的潛力。因此，苦碟子醇提物的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)亟待被闡明。

超高效液相色譜-線性離子阱串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-LTQ-Orbitrap MS）具有良好的分離效果及強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)表征能力，已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜成分的研究中。本研究利用LTQ-Orbitrap串聯(lián)質(zhì)譜將LTQ 的靈敏快速和Orbitrap 的高分辨、高質(zhì)量準(zhǔn)確度結(jié)合起來，闡明苦碟子提取物經(jīng)大孔樹脂分離的30%、50%、70%和95%乙醇洗脫部位的化學(xué)成分及其差異，表征苦碟子醇提物復(fù)雜系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為其活性部位的篩選提供依據(jù)。

1 材料

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀，LTQ-Orbitrap XL 質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）、Xcalibur 2.1化學(xué)工作站（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；R200D型分析天平（十萬分之一，德國(guó)Satorius 公司）。

3-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：18030620）、4-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：18031001）、5-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：18032403）、阿魏酸（批號(hào)：18032601）、原兒茶醛（批號(hào)：18031305）、3，4-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：18031602）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：18031610）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：18031604）、咖啡酸（批號(hào)：18032003）、芹菜素（批號(hào)：18032605）、木犀草素（批號(hào)：18012605）、芹菜素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷（批號(hào)：18012505）、木犀草-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷（批號(hào)：17121210）、鳥苷（批號(hào)：18031603）、腺苷（批號(hào)：18022801）對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，純度均＞98%），木犀草素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品（廣州綠百草生物科技有限公司，批號(hào)：HN156300U，純度＞98%）。苦碟子藥材購自通云聯(lián)商貿(mào)保定有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院劉穎副研究員鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜

Ixeris sonchifolia

（Bunge）Hance 的全草。乙醇（北京化工廠，分析純），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），甲酸、乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，質(zhì)譜純）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用 Waters Acquity UPLC BEH C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫35℃，流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸-水溶液（B），流速0.3 mL·min，進(jìn)樣量2 μL，不同洗脫部位采用不同洗脫梯度：30%乙醇部位洗脫程序（0 ～1 min，5%A；1 ～4 min，5% ～10%A；4 ～28 min，10% ～30%A；28 ～30 min，30%～90%A；30 ～31 min，90%A；31 ～33 min，90%～5%A；33 ～35 min，5%A）；50%乙醇部位洗脫程序（0 ～1 min，5%A；1 ～4 min，5% ～20%A；4 ～28 min，20% ～40%A；28 ～30 min，40%～90%A；30 ～31 min，90%A；31 ～33 min，90%～5%A；33 ～35 min，5%A）；70%乙醇部位洗脫程序（0 ～1 min，5%A；1 ～4 min，5% ～40%A；4 ～28 min，40% ～60%A；28 ～30 min，60%～90%A；30 ～31 min，90%A；31 ～33 min，90%～5%A；33 ～35 min，5%A）；95%乙醇部位洗脫程序（0 ～1 min，5%A；1 ～2 min，5% ～50%A；2 ～30 min，50% ～90%A；30 ～31 min，90%A；31 ～33 min，90% ～5%A；33 ～35 min，5%A）。

2.2 質(zhì)譜條件

負(fù)離子檢測(cè)模式，電噴霧離子源（ESI），鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?，純度?9%；鞘氣流速40 個(gè)單位，輔助氣流速20 個(gè)單位；碰撞氣為氦氣，純度＞99.99%；電離源電壓3.0 kV；離子源溫度350℃；管透鏡電壓110 V；干燥氣流速 15 L·min；碰撞電壓6 ～10 V；一級(jí)質(zhì)譜圖譜采用傅里葉變換高分辨全掃描（FT），質(zhì)量掃描范圍

m/z

100 ～1200；檢測(cè)分辨率30 000；二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)依賴型掃描（DDS），選取一級(jí)豐度最高的3個(gè)離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（CID）碎片掃描，CID 激活單位0.25 q，激活時(shí)間30 ms，歸一化碰撞能量為35%。對(duì)于未產(chǎn)生二級(jí)碎片的母離子采取具有針對(duì)性的母離子列表掃描（PL）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 苦碟子藥材中加入70%乙醇回流提取3 次：第一次10 倍量2 h，第二次8 倍量1 h，第三次8 倍量1 h，藥液過濾，合并3 次濾液，回收乙醇，濃縮至無醇味，得濃縮藥液。D101 大孔樹脂預(yù)處理后，濕法裝柱，上樣。分別經(jīng)3 倍柱體積的30%、50%、70%和95%乙醇洗脫，收集各部位洗脫液，濃縮、干燥，得苦碟子藥材醇提物的30%、50%、70%和95%乙醇洗脫部位干膏。分別稱取各洗脫部位干膏適量，置10 mL 量瓶中，分別加對(duì)應(yīng)洗脫溶劑定容，混勻，制成質(zhì)量濃度為24 mg·mL的苦碟子不同洗脫部位的溶液，超聲處理10 min，放冷，13 000 r·min離心15 min，過0.22 μm 微孔濾膜，濾過，濾液即為苦碟子醇提物不同洗脫部位供試品溶液。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液 分別稱取3-咖啡?？鼘幩?、4-咖啡?？鼘幩?、5-咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、阿魏酸、芹菜素、芹菜素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷、木犀草素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷、鳥苷、腺苷和原兒茶醛對(duì)照品適量，置10 mL 量瓶中，分別加入30%、50%、70%和95%乙醇溶解，制成對(duì)照品溶液。分別精密量取上述各對(duì)照品溶液0.5 mL，置10 mL 量瓶中，加入對(duì)應(yīng)濃度的乙醇制成各成分質(zhì)量濃度為30 μg·mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

分別從國(guó)內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)庫（PubMed，知網(wǎng)等）相關(guān)研究文獻(xiàn)中獲得苦碟子藥材中130 個(gè)成分的信息，建立苦碟子藥材化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。采用高分辨數(shù)據(jù)處理軟件QualBrowser of Xcalibur 2.1（Thermo Fisher Scientific），根據(jù)各成分碳、氫、氧原子的個(gè)數(shù)計(jì)算精確相對(duì)分子質(zhì)量，依據(jù)測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量與理論精確相對(duì)分子質(zhì)量的偏差小于5 的原則，確定各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的分子式，在已建立的苦碟子藥材化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中檢索匹配的化合物。根據(jù)對(duì)照品確定每類化合物的裂解規(guī)律和診斷離子，結(jié)合特征性多級(jí)質(zhì)譜裂解碎片信息、相對(duì)豐度或參考文獻(xiàn)等，進(jìn)一步推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)。對(duì)于裂解規(guī)律一致的同分異構(gòu)體，采用ChemBioDraw Ultra 14.0 軟件給出的有機(jī)化合物疏水常數(shù)（ClogP）對(duì)極性進(jìn)行判斷，同時(shí)結(jié)合化合物的保留時(shí)間進(jìn)行推測(cè)。

3 結(jié)果

采用上述經(jīng)優(yōu)化的液相色譜、質(zhì)譜檢測(cè)條件，采集苦碟子醇提物不同洗脫部位負(fù)離子模式下的UHPLC-LTQ-Orbitrap MS數(shù)據(jù)，分別在30%、50%、70%和95%乙醇洗脫部位中鑒定出化合物36、56、33 和 15 個(gè)，共計(jì)80 個(gè)，見表1。各化合物的位置分別在基峰離子流圖（BPI）中進(jìn)行了標(biāo)記，見圖1。

圖1 苦碟子醇提物不同洗脫部位的負(fù)離子模式BPI 離子流圖Fig 1 Based peak ion chromatogram of four different elution parts from Ixeris sonchifolia（Bunge）Hance alcohol extract at negative ion mode

表1 苦碟子醇提物中化學(xué)成分的UHPLC-LTQ-Orbitrap MS 鑒定
Tab 1 Identification of chemical constituents in （Bunge）Hance alcohol extract by UHPLC-LTQ-Orbitrap MS

誤差（δ）MS2 碎片離子信息理論值[M-H]－（m/z）不同極性部位化合物分類實(shí)測(cè)值[M-H]－（m/z）化合物tR/min鑒定成分分子式參考文獻(xiàn)A B C D 1＊ 0.95鳥苷C10H13O5N5 282.0832 282.08371.58 149.9625，132.9389＋ － － － 核苷 [14]2 1.03胸苷C10H14O5N2 241.0818 241.08190.01 125.02448＋ － － － 核苷 [14]3＊ 1.25腺苷C10H13O4N5 266.0883 266.08850.21 134.0472，119.0342＋ － － － 核苷 [14]4＊ 4.78咖啡酸C9H8O4179.0338 179.03470.83 134.9064，149.0669－ ＋ － － 有機(jī)酸[17-18]5＊ 3.753-咖啡?；鼘幩酑16H18O9353.0867 353.0867 －0.01 190.9723，178.9535，135.0316，126.9852，173.0044＋ － － － 有機(jī)酸[17-18]6＊ 5.745-咖啡?；鼘幩酑16H18O9353.0867 353.0865 －0.16 190.9367，172.9447，178.9389，134.8889，126.9735 7＊ 6.31，4.984-咖啡?；鼘幩酑16H18O9353.0867 353.0864 －0.79 173.0088，179.0653，190.9670，134.8661，126.9032 8＊ 14.74，7.28 3，4-二咖啡?；鼘幩酑25H24O12 515.1184 515.11891.08 353.1740，335.2506，172.9343，190.9932，178.9199 9＊ 15.03，7.44 3，5-二咖啡酰基奎寧酸C25H24O12 515.1184 515.11921.55 353.1416，335.2243，178.9913，190.9797 10＊ 17.42，8.15 4，5-二咖啡?；鼘幩酑25H24O12 515.1184 515.11890.97 353.1524，335.2575，172.9678，191.0606 11 6.22咖啡酸酐C18H14O7341.0655 341.06580.74 323.2537，297.2859，135.0569，179.0239＋ － － － 有機(jī)酸[17-18]＋ ＋ － － 有機(jī)酸[17-18]＋ ＋ － － 有機(jī)酸[17-18]＋ ＋ － － 有機(jī)酸[17-18]＋ ＋ － － 有機(jī)酸[17-18]－ － ＋ － 有機(jī)酸[17-18]12＊ 6.72阿魏酸C10H10O4193.0495 193.04971.22 148.9787，178.0009－ ＋ － － 有機(jī)酸[17-18]13 5.923-阿魏酰基奎寧酸C17H20O9367.1023 367.1022 －0.19 192.9945，172.8985，149.0632，178.0346－ ＋ － － 有機(jī)酸[20]14 10.035-阿魏?；鼘幩酑17H20O9367.1023 367.10250.58 190.9325，193.0605，173.0560，148.9353 15 2.36香草酸C8H8O4167.0338 167.03464.52 151.9472，138.9520，148.8305 16 10.39，6.36 菊苣酸C22H18O12 473.0714 473.07170.63 311.0013，293.0808，178.9905，148.9752－ ＋ － － 有機(jī)酸[20]＋ － － － 有機(jī)酸[21]＋ ＋ － － 有機(jī)酸[22]17 13.224-羥基肉桂酸C9H8O3163.0389 163.03964.41 118.8751，134.9474＋ － － － 有機(jī)酸[15]18 4.10，8.69原兒茶酸乙酯C9H10O4181.0495 181.05034.67 162.9411，134.9533＋ ＋ － － 有機(jī)酸[16]19 23.80棕櫚酸C16H32O2255.2318 255.23304.60 237.2862，212.9304，150.8556，187.0291，145.0186，168.9726－ － － ＋有機(jī)酸[23]20 20.83亞油酸C18H32O2279.2318 279.23304.42 162.982，261.220－ － － ＋有機(jī)酸[23]21＊ 21.41，11.11，6.00，4.16木犀草素C15H10O6285.0393 285.03992.05 242.9833，241.1196，217.0558，199.0383，174.9084，150.9541，257.1585，132.8712＋ ＋ ＋ ＋黃酮 [24]22＊ 25.53，14.05，6.52，4.40芹菜素C15H10O5269.0444 269.04491.86 240.9628，225.1033，227.0105，182.8081，201.0117，151.0273，148.9479 23＊ 13.21，6.81，5.02，3.74木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 C21H20O11447.0921 447.09260.97 285.0740，151.0812，132.8881 24＊ 15.88，8.37，5.32，3.83芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷C21H20O10 431.0972 431.09791.67 269.0475，150.9182，183.0488，149.0275＋ ＋ ＋ ＋黃酮 [24]＋ ＋ ＋ ＋黃酮 [25]＋ ＋ ＋ ＋黃酮 [25]25＊ 13.06木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷C21H18O12 461.0714 461.07170.71 285.1198＋ － － － 黃酮 [25]

3.1 核苷類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

苦碟子醇提物中共鑒定出3 個(gè)核苷類化合物，即化合物1 ～3。核苷類為水溶性成分，僅在30%乙醇洗脫部位被檢測(cè)到。通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)，化合物1 和3 分別鑒定為鳥苷和腺苷。鳥苷和腺苷準(zhǔn)分子離子分別為

m/z

282.0837 [M-H]，

m/z

266.0885 [MH]，丟失一分子核糖后，分別得到碎片離子

m/z

150 [M-H-Rib]，

m/z

134 [M-H-Rib]。 腺苷的裂解方式見圖2?；衔? 的準(zhǔn)分子離子為

m/z

241.0819 [M-H]，丟失一分子脫氧核糖得到碎片離子

m/z

125 [M-H-Derib]。結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物2 為胸苷。

圖2 負(fù)離子模式下腺苷的裂解途徑Fig 2 Fragmentation pathways of adenosine at negative ion mode

續(xù)表1

誤差（δ）MS2 碎片離子信息理論值[M-H]－（m/z）不同極性部位化合物分類實(shí)測(cè)值[M-H]－（m/z）化合物tR/min鑒定成分分子式參考文獻(xiàn)A B C D 26 13.63芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷C21H18O11445.0765 445.07690.88 269.1153＋ － － － 黃酮 [25]27 16.74木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷甲酯C22H20O12 475.0871 475.08740.753 299.1416，285.1337＋ － － － 黃酮 [26]28 16.10芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷甲酯C22H20O11459.0921 459.0901 －4.50 327.1983，269.3598＋ － － － 黃酮 [26]29 16.89，10.09 木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷乙酯C23H22O12 489.1027 489.10331.12 285.0047，313.0936＋ ＋ － － 黃酮 [26]30 10.86，6.11，4.73木犀草素-7-O-龍膽二糖苷C27H30O16 609.1450 609.1446 －0.59 285.0360＋ ＋ ＋ － 黃酮 [26]31 22.60刺槐素-7-O-蕓香糖苷C28H32O14 591.1708 591.1706 －0.31 283.1177，267.9120，576.4531 32 15.66異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷 C22H22O12 477.1027 477.10321.09 315.1221，300.1449，462.1204，341.1961，179.1619 33 14.59，7.51 ixerin ZC21H26O9421.1493 421.14990.59 241.0850，259.0318，215.0639，197.0843，200.1062，187.0686 34 14.34，7.33 sonchifoliactone AC21H26O9421.1493 421.15020.94 215.1326，241.3954，259.2861，197.9326，35 5.61ixerin Z1C30H34O10 553.2068 553.2053 －2.61 421.2558，241.0537，259.0528，215.1886 36 10.89苦荬菜內(nèi)酯BC29H32O11555.1860 555.18610.02 421.2998，241.2181，215.1785，258.8739＋ － － － 黃酮 [27]＋ － － － 黃酮 [28]＋ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[30]＋ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[31]－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[32]－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[32]37 11.76，6.68，8.68苦荬菜內(nèi)酯D C21H28O10 439.1598 439.16010.23 160.9871，261.2146，421.2809，241.0379，259.0194，215.0575＋ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[32]38 7.5，8.833-hydroxydehydroleucodinC15H16O4259.0964 259.09700.54 215.0912，186.9824，197.0114，200.0792 39 5.47，6.69苦荬菜內(nèi)酯EC15H18O5277.1070 277.10760.55 233.101，259.076，215.152，203.103，205.1730＋ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[32]－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[32]40 6.76，5.0611，13-dihydro-13-prolyl-ixerin Z C26H35O11N 536.2126 536.21270.07 421.2335，241.0443，215.0615，259.1382，377.2057＋ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[32]41 15.14ixerin Z2C30H34O12 585.1966 585.19720.62 259.0314，325.1713，215.0910 42 8.01，5.55苦荬菜內(nèi)酯CC21H28O11455.1547 455.1529 －1.84 409.2302，293.1419，248.9942，231.2059，275.0718，257.1704，239.1034，437.2281 43 9.15，5.829α-hydroxyzaluzalin CC15H18O4261.1121 261.11270.65 243.1606，187.0282，217.0922，198.9852，201.9225－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[32]＋ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[32]－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]44 9.69，6.82sonchifoliasolide DC15H18O4261.1121 261.11250.44 162.8843，217.0017－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]45 10.98，7.37 sonchifoliasolide FC15H18O4261.1121 261.11270.56 217.1900，243.0818，199.1300，233.0455－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]46 14.90，7.56 11-epi-8-desoxyartelinC15H18O4261.1121 261.11220.38 162.9197，199.1335 － ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]47 15.59，7.73 苦荬菜內(nèi)酯AC15H18O4261.1121 261.11230.16 163.0399，217.1230 － ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]

續(xù)表1

誤差（δ）MS2 碎片離子信息理論值[M-H]－（m/z）A B C D實(shí)測(cè)值[M-H]－（m/z）不同極性部位化合物分類化合物tR/min鑒定成分分子式參考文獻(xiàn)48 6.87，5.06ixerin XC21H28O9423.1649 423.16550.57 261.078，217.0214，199.0085，243.0502，187.1177，160.9234－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]49 11.13，6.19 11，13α-dihydroixerin ZC21H28O9423.1649 423.16510.20 261.0785，217.0791，198.9445，243.1490，160.9787，379.2991 50 12.15，6.61 sonchifoliasolide MC21H28O9423.1649 423.16570.83 217.0997，261.0827，199.0487，243.0825，160.9739 51 13.03，7.19 ixerinosideC21H28O9423.1649 423.16590.99 160.8899，178.8956，261.2669 52 9.25ixerin ZAC30H34O11569.2017 569.1999 －0.44 245.0634，198.9803，217.0734－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]－ ＋ ＋ － 倍半萜內(nèi)酯[33]－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[34]53 8.7615-hydroxy-2-oxo-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-3-ene-12，6-carbolactone isomer1 54 9.1715-hydroxy-2-oxo-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-3-ene-12，6-carbolactone isomer 2 55 10.6415-hydroxy-2-oxo-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-3-ene-12，6-carbolactone isomer 3 56 11.2215-hydroxy-2-oxo-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-3-ene-12，6-carbolactone isomer 4 57 15.3315-hydroxy-2-oxo-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-3-ene-12，6-carbolactone isomer 5 C15H20O4263.1277 263.12810.38 219.1249，201.0794，204.0703，245.1068 C15H20O4263.1277 263.12830.60 219.0506，201.0217，204.0535，245.1414 C15H20O4263.1277 263.12850.78 152.9410，219.0904，245.2025，200.9324 C15H20O4263.1277 263.12881.06 219.0418，245.0872，200.9820 C15H20O4263.1277 263.12810.35 219.1623，201.2621，204.2135，245.0675－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[35]－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[35]－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[35]－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[35]－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[35]58 6.4211，13-dihydro ixerinosideC21H30O9425.1806 425.18120.60 381.2223，407.2079，160.9069，425.3787－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[36]59 7.121（10）E-4Z-3α-hydroxygermacra-1（10），4，11（13）-trien-6，12-olide-14-Oβ-D-glucopyranoside C21H30O9425.1806 425.18130.73 263.1763，381.2719，219.1718，160.9699，201.0607，191.0788－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[36]60 8.45sonchifoliasolide NC21H30O9425.1806 425.18070.18 217.0802，397.3383，381.4176，160.9103，263.1326，218.9423－ ＋ － － 倍半萜內(nèi)酯[36]61 8.73，7.43，5.16 62 9.08，8.46，6.07 63 9.32，8.86，6.53 11β，13-dihydrosantamarine isomer 1 11β，13-dihydrosantamarine isomer 2 11β，13-dihydrosantamarine isomer 3 C15H22O3249.1485 249.14860.75 231.0644，205.0952，112.8087，187.1413 C15H22O3249.1485 249.14920.71 231.1215，204.9694，112.8748，187.0670 C15H22O3249.1485 249.1485 －0.01 231.0803，112.8321，205.0531，187.0425－ ＋ ＋ ＋倍半萜內(nèi)酯[37]－ ＋ ＋ ＋倍半萜內(nèi)酯[37]－ ＋ ＋ ＋倍半萜內(nèi)酯[37]64 9.67，9.75，10.37 11β，13-dihydrosantamarine isomer 4 C15H22O3249.1485 249.14890.47 231.1137，205.1126－ ＋ ＋ ＋倍半萜內(nèi)酯[37]65 10.00，19.22，13.41 11β，13-dihydrosantamarine isomer 5 C15H22O3249.1485 249.14880.31 231.0367，112.8120，205.0866，187.1329－ ＋ ＋ ＋倍半萜內(nèi)酯[37]66 29.07，17.57 齊墩果酸C30H48O3455.3519 455.35260.66 407.4558，392.8099，246.9978，207.0420，201.9056，188.8137－ － ＋ ＋三萜 [38-39]67 9.16抱莖苦荬菜皂苷AC41H66O13 765.4419 765.4408 －1.17 603.2392，471.4506－ － ＋ － 三萜 [32]

續(xù)表1

注：表示與對(duì)照品比對(duì)后鑒定（ indicates the compound was identified by comparison with reference standards）；極性部位A ～D 分別為30%、50%、70%、95%乙醇洗脫部位（polar part A ～D represent 30%，50%，70%，95% ethanol elution part respectively）。

誤差（δ）MS2 碎片離子信息理論值[M-H]－（m/z）不同極性部位化合物分類實(shí)測(cè)值[M-H]－（m/z）化合物tR/min鑒定成分分子式參考文獻(xiàn)A B C D 68 6.69抱莖苦荬菜皂苷BC54H88O23 1103.5632 1103.5627 －0.53 －－ － ＋ － 三萜 [32]69 6.46抱莖苦荬菜皂苷CC48H78O19 957.5053 957.50580.50 －－ － ＋ － 三萜 [32]70 5.28抱莖苦荬菜皂苷DC53H86O23 1089.5476 1089.55052.93 －－ － ＋ － 三萜 [32]71 6.05，5.06，6.00，5.04七葉內(nèi)酯C9H6O4177.0182 177.01900.81 132.8155，148.9030，159.0455＋ ＋ ＋ ＋苯丙素[40]72 15.88，7.70，6.31丁香脂素C22H26O8417.1543 417.1541 －0.25 349.3329，387.5605，181.4032，166.0541＋ ＋ ＋ － 苯丙素[41]73 7.04，23.86 1β，2α，3β，4α-1，2-二甲基-3，4-二苯基（2、4、5-三甲氧基苯）-環(huán)丁烷C24H32O6415.2115 415.21320.72 329.2530，351.4585，268.2189，296.0988－ － ＋ ＋苯丙素[41]74 10.48，6.96，4.79苦荬菜木脂素AC26H36O12 539.2123 539.21381.57 493.2413，509.3674，377.0742，152.8578＋ ＋ ＋ － 苯丙素[41]75 10.85，7.48，5.13苦荬菜木脂素BC26H36O12 539.2123 539.21331.02 377.2081，508.3366＋ ＋ ＋ － 苯丙素[41]76 12.894，8-（3’-甲氧基，4’-羥基）-二苯基-2，6-二羥基雙四氫呋喃木脂素C20H22O8389.1230 389.12411.09 313.2358，374.3616，150.5052 77 30.18胡蘿卜苷C35H60O6575.4306 575.4303 －0.26 295.2923，278.3095，412.7796 78 4.98東莨菪素C10H8O4191.0338 190.02630.28 175.9004，147.0115，159.0661 79 31.45，22.37 6，10，14-三甲基-2-戊烷酮 C18H36O267.2682 267.26861.41 223.1161，249.1018，216.9640，98.8270－ ＋ － － 苯丙素[41]－ － ＋ － 其他 [42]－ ＋ － － 其他 [43]－ － ＋ ＋其他 [44]80＊ 4.52，4.30原兒茶醛C7H6O3137.0233 137.02441.08 108.8475，121.9829，92.9162，74.7270＋ ＋ － － 其他 [45]

3.2 有機(jī)酸類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

苦碟子醇提物中共鑒定出17 個(gè)有機(jī)酸類成分，即化合物4 ～20，基本結(jié)構(gòu)為苯丙酸，如咖啡酸、阿魏酸、4-羥基桂皮酸、咖啡酸酐。此類化合物易丟失中性碎片CO（44 Da）分別產(chǎn)生二級(jí)碎片離子

m/z

135，

m/z

149，

m/z

119，

m/z

297；與奎寧酸結(jié)合易縮合為酯類化合物，如3-咖啡?？鼘幩?，5-咖啡?？鼘幩?，4-咖啡?？鼘幩幔?，4-二咖啡?？鼘幩?，3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡?？鼘幩?，3-阿魏酰奎寧酸，5-阿魏酰奎寧酸，此類化合物容易脫去咖啡酰基（caffeoyl）或阿魏?；╢eruloyl）產(chǎn)生碎片離子

m/z

191，脫去奎寧酸（quinic acid）產(chǎn)生碎片離子

m/z

179 或

m/z

193，繼續(xù)丟失中性碎片CO（44 Da），HO（18 Da），CO（28 Da），產(chǎn)生碎片離子

m/z

135，

m/z

173，

m/z

127。如化合物13、14 互為同分異構(gòu)體，具有相同的準(zhǔn)分子離子

m/z

367.10 [M-H]和碎片離子

m/z

149 [M-H-quinic acid-CO]，

m/z

178 [M-H-quinic acid-CH]，在二級(jí)質(zhì)譜圖中，化合物13 產(chǎn)生基峰離子

m/z

193[M-H-quinic acid]，化合物14 產(chǎn)生基峰離子

m/z

191 [M-H-feruloyl]，結(jié)合參考文獻(xiàn)和碎片離子的相對(duì)豐度，推斷化合物13 和14 分別為3-阿魏酰奎寧酸、5-阿魏?？鼘幩?。5-阿魏?？鼘幩岬牧呀馔緩揭妶D3。

圖3 負(fù)離子模式下5-阿魏?？鼘幩岬牧呀馔緩紽ig 3 Fragmentation pathways of 5-feruloylqunic acid at negative ion mode

3.3 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

苦碟子醇提物中共鑒定出12 個(gè)黃酮類化合物，即化合物21 ～32，均在30%乙醇洗脫部位被檢測(cè)到，分為黃酮類和甲氧基取代黃酮類。

黃酮類包括木犀草素、芹菜素和以其為苷元的黃酮苷類化合物，即化合物21 ～30。該類化合物均給出顯著的分子離子峰 [M-H]，其主要裂解特征通常為C 環(huán)開環(huán)，丟失中性碎片CO（28 Da），CO（44 Da），HO（18 Da）。碎片離子

m/z

285，

m/z

151，

m/z

133 和碎片離子

m/z

269，

m/z

151，

m/z

149 可以分別作為以木犀草素和芹菜素為苷元的黃酮類化合物的特征診斷離子。木犀草素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷，木犀草-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷和芹菜素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷C-7 位的糖苷鍵易斷裂，分別得到穩(wěn)定的母核碎片離子，即苷元木犀草素和芹菜素。如化合物25 的準(zhǔn)分子離子為

m/z

461.0717 [M-H]，丟失一分子葡萄糖醛酸取代基（GlcA，176 Da）后產(chǎn)生碎片離子

m/z

285 [M-H-GlcA]?；衔?5 與對(duì)照品的保留時(shí)間比對(duì)后，鑒定為木犀草素-7-

Oβ

-

D

-葡萄糖醛酸苷，裂解方式見圖4。

圖4 負(fù)離子模式下木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathways of luteolin-7-O-β-D-glucuronide in negative mode

化合物31 和32 為甲氧基取代黃酮類化合物，此類化合物易丟失甲基自由基（15 Da）。化合物31 的準(zhǔn)分子離子為

m/z

591.1706 [M-H]，丟失端基脫氧六碳糖基（146 Da）和葡萄糖基（162 Da）后產(chǎn)生二級(jí)碎片離子

m/z

283 [M-H-CHO-Glc]，進(jìn)一步脫去甲基（15 Da）生成碎片離子

m/z

268 [M-H-146-Glc-CH]。結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物31 為刺槐素-7-

O

-蕓香糖苷?；衔?2的準(zhǔn)分子離子為

m/z

477.1032 [M-H]，脫去葡萄糖基（162 Da）產(chǎn)生碎片離子

m/z

315 [M-H-Glc]，脫去甲基（15 Da）后生成碎片離子

m/z

300 [M-HGlc-CH]，黃酮母核C 環(huán)開環(huán)產(chǎn)生開環(huán)離子

m/z

341 [A ＋Glc]，繼續(xù)產(chǎn)生碎片離子A。與文獻(xiàn)比對(duì)，推斷化合物32 為異鼠李素-3-

Oβ

-

D

-葡萄糖苷。

3.4 倍半萜內(nèi)酯類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

苦碟子醇提物中共鑒定出33 個(gè)倍半萜內(nèi)酯類化合物，即化合物33 ～65。苦碟子中倍半萜內(nèi)酯類化合物種類與數(shù)量較多，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，該類化合物母核以愈創(chuàng)木烷型和桉烷型為主。

化合物33 ～60 是以愈創(chuàng)木烷型為母核的倍半萜內(nèi)酯類化合物。在負(fù)離子模式下其主要準(zhǔn)分子離子有

m/z

421，

m/z

423，

m/z

555，

m/z

553，

m/z

259，

m/z

261，常丟失中性碎片CO（44 Da）產(chǎn)生

γ

-內(nèi)酯環(huán)特征碎片離子

m/z

217，

m/z

219，

m/z

215，丟失HO（18 Da），CO（28 Da），Glc（162 Da），CH（15 Da）產(chǎn)生以

m/z

259，

m/z

261，

m/z

217，

m/z

197，

m/z

241 為主的特征診斷離子。如化合物33 在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為

m/z

421.1499 [M-H]。二級(jí)碎片離子有：

m/z

259[M-H-Glc]，

m/z

241 [M-H-Glc-HO]，

m/z

215[M-H-Glc-CO]，

m/z

200 [M-H-Glc-CO-·CH]，

m/z

187 [M-H-Glc-CO-CO]，裂解方式見圖5。結(jié)合參考文獻(xiàn)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，推斷化合物33 為ixerin Z?；衔?4 和33 具有相同的準(zhǔn)分子離子和二級(jí)碎片離子，但化合物33 的ClogP 值高于化合物34，ClogP 值越小，在反相色譜上的保留時(shí)間越短，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物34為sonchifoliactone A。

圖5 負(fù)離子模式下ixerin Z 的裂解途徑Fig 5 Fragmentation pathways of ixerin Z at negative ion mode

化合物61 ～65 是以桉烷型為母核的倍半萜內(nèi)酯類化合物。在負(fù)離子模式下主要產(chǎn)生以

m/z

249，

m/z

231，

m/z

205 為主的特征離子。此類化合物均產(chǎn)生

γ

-內(nèi)酯環(huán)特征碎片

m/z

205 [M-H-CO]，化合物61 ～65 具有相同的準(zhǔn)分子離子

m/z

249[M-H]和二級(jí)碎片離子

m/z

231 [M-H-HO]，

m/z

205 [M-H-CO]，

m/z

187 [M-H-CO-HO]，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推測(cè)其為11

β

，13-dihydrosantamarine的5 個(gè)同分異構(gòu)體。

3.5 三萜類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

苦碟子醇提物中共鑒定出5 個(gè)三萜類成分，即化合物66 ～70?；衔?6 在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子為

m/z

455.3526 [M-H]。二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子為

m/z

407 [M-H-HCOOH-2H]，由于分子中存在C雙鍵，具環(huán)己烯結(jié)構(gòu)，C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解，產(chǎn)生碎片離子

m/z

207[M-H-CHO]、

m/z

247 [M-H-CHO]。 根據(jù)以上裂解方式，結(jié)合參考文獻(xiàn)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，推斷化合物66 為齊墩果酸?；衔?7 的準(zhǔn)分子離子為

m/z

765.4408 [M-H]，二級(jí)質(zhì)譜中，丟失一分子葡萄糖基產(chǎn)生碎片離子

m/z

603[M-H-Glc]，再丟失一分子阿拉伯糖基（Ara）形成碎片離子

m/z

471 [M-H-Glc-Ara]，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物67 為抱莖苦荬菜皂苷A，裂解方式見圖6。化合物68 ～70 分別產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子

m/z

1103.5627 [M-H]，

m/z

957.5058 [MH]和

m/z

1089.5505 [M-H]，未檢測(cè)到二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物68 ～70分別為抱莖苦荬菜皂苷B、C、D。

圖6 負(fù)離子模式下抱莖苦荬菜皂苷A 裂解途徑Fig 6 Fragmentation pathways of ixeris saponin A at negative ion mode

3.6 苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

苦碟子醇提物中共鑒定出6 個(gè)苯丙素類成分，即化合物71 ～76。化合物71 為香豆素類化合物，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子為

m/z

177.0190 [M-H]。二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子有：

m/z

133 [M-H-CO]，149 [M-H-CO]，159 [M-HHO]，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物71 為七葉內(nèi)酯?；衔?2 ～76 均為木脂素類化合物。在負(fù)離子模式下，分別產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子

m/z

417.1541[M-H]，415.2132 [M-H]，539.2138 [M-H]，539.2133 [M-H]，389.1241 [M-H]。此類化合物易丟失甲基或甲氧基，并發(fā)生芐基裂解。以化合物72 為例，二級(jí)碎片離子為

m/z

387 [M-H-2CH]，181 [M-H-CHO]，166 [M-H-2CH-CHO-CH]，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物72 為丁香脂素，裂解途徑見圖7。

圖7 負(fù)離子模式下丁香脂素的裂解途徑Fig 7 Fragmentation pathways of syringaresinol at negative ion mode

3.7 其他類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

苦碟子醇提物中共鑒定出4 個(gè)其他類成分，即化合物77 ～80?；衔?7 在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子為

m/z

575.4303 [M-H]。二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子有：

m/z

295 [M-H-CHOGlu]、278 [M-H-CH]、413 [M-H-Glu]，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物77 為胡蘿卜苷?；衔?8 的準(zhǔn)分子離子為

m/z

190.0263 [M-H]。二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子有：

m/z

176 [M-H-CH]，147 [M-H-CO]，159 [M-H-CH-OH]，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物78 為東莨菪素?；衔?9 的準(zhǔn)分子離子為

m/z

267.2686 [M-H]，產(chǎn)生碎片離子

m/z

223 [M-H-CH]，249 [M-H-HO]，結(jié)合參考文獻(xiàn)，推斷化合物79 為6，10，14-三甲基-2-戊烷酮?；衔?0 的準(zhǔn)分子離子為

m/z

137.0244 [M-H]，產(chǎn)生

m/z

109 [M-H-HO]的碎片離子，結(jié)合參考文獻(xiàn)并經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，化合物80 鑒定為原兒茶醛。

3.8 苦碟子不同洗脫部位成分比較

苦碟子醇提物中共鑒定出80 個(gè)化學(xué)成分，其中核苷類化合物3 個(gè)，有機(jī)酸類化合物17 個(gè)，黃酮類化合物12 個(gè)，倍半萜內(nèi)酯類化合物33 個(gè)，三萜類化合物5 個(gè)，苯丙素類化合物6 個(gè)，其他類成分4 個(gè)。各洗脫部位存在5 個(gè)共有成分，分別為木犀草素、芹菜素、木犀草素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷、芹菜素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷和七葉內(nèi)酯，其特有成分的數(shù)量在30%、50%、70%、95%乙醇洗脫部位中分別為13、21、7、2 個(gè)，詳細(xì)分布見圖8。由于逐級(jí)系統(tǒng)溶劑洗脫的緣故，化合物主要分布在前3 個(gè)洗脫部位，核苷類和黃酮苷類化合物主要存在于30%乙醇洗脫部位中，倍半萜內(nèi)酯類化合物主要存在于50%乙醇洗脫部位中，三萜類和苯丙素類化合物主要存在于70%乙醇洗脫部位中，棕櫚酸和亞油酸僅存在于95%乙醇洗脫部位中。

圖8 苦碟子醇提物不同洗脫部位化合物數(shù)量維恩圖分析Fig 8 Venn diagrams of different elution parts in Ixeris sonchifolia（Bunge）Hance alcohol extract

4 討論

LTQ 的靈敏快速和Orbitrap 的高分辨、高質(zhì)量準(zhǔn)確度的結(jié)合使UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技術(shù)應(yīng)用于中藥復(fù)雜系統(tǒng)的分析具有很大的優(yōu)勢(shì)，增加了苦碟子醇提物各洗脫部位中的微量成分的檢出。研究中發(fā)現(xiàn)苦碟子醇提物中的多類成分在負(fù)離子檢測(cè)模式下，色譜峰更豐富，質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)，故選擇負(fù)離子模式檢測(cè)各成分的質(zhì)譜信息。按照化合物的極性大小將苦碟子醇提物分為30%、50%、70%和95%乙醇4 個(gè)洗脫部位，有利于降低液質(zhì)聯(lián)用分析成分時(shí)的共流出，減少質(zhì)譜檢測(cè)過程中離子的競(jìng)爭(zhēng)，更好地采集到目標(biāo)性成分，提高檢測(cè)的靈敏度，可全面表征苦碟子藥材醇提物的復(fù)雜成分體系，有利于進(jìn)一步篩選其有效部位。

現(xiàn)代藥理研究表明，本研究鑒定出的80 個(gè)成分大多具有降低心肌耗氧量、增加冠脈流量和血流量、抗血栓、抗腫瘤等作用。腺苷作為苦碟子注射液質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，具有明顯的降低全血黏度、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)和缺血缺氧的狀態(tài)等作用?？嗟又械挠袡C(jī)酸類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、止痛等作用，其中4-咖啡?？鼘幩?、5-咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、阿魏酸為抑制血小板聚集、防止血栓形成的活性成分?？嗟又悬S酮類化合物含量較高，是主要的生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基能力、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、降低血小板聚集、減輕心肌梗死等多種藥理活性，其中，木犀草素和芹菜素為抗腫瘤作用的活性成分。有文獻(xiàn)報(bào)道倍半萜內(nèi)酯類化合物具有顯著的抗腫瘤作用。三萜類化合物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的生理功能。原兒茶醛具有抗血栓形成、抗膿血、抗病毒、抗纖維化等廣泛的藥理活性。因此，苦碟子醇提物化學(xué)成分的全面表征將為進(jìn)一步從苦碟子中分離出清熱解毒、涼血活血的藥效活性成分提供一定的依據(jù)。30%、50%、70%、95%乙醇洗脫部位中的共有成分為木犀草素、芹菜素、木犀草素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷、芹菜素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖苷和七葉內(nèi)酯。30%和50%乙醇洗脫部位的特有成分較多，分別為13 個(gè)和21 個(gè)，提示苦碟子醇提物的活性成分群可能存在于30%和50%乙醇洗脫部位中。

本研究建立了一種簡(jiǎn)便快速的苦碟子醇提物化學(xué)成分鑒定的UHPLC-LTQ-Orbitrap MS分析方法，并對(duì)各洗脫部位的成分差異進(jìn)行了比較。研究結(jié)果為苦碟子醇提物活性部位的篩選提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)，為苦碟子的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了參考。