易 默，吳友偉，張 健，何 瑜，劉 倩，史麗萍，呂颯美

（陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)二科，西安 710068）

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。研究[1]發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿（OMT）通過上調(diào)miR-211-5p 可減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。OMT 可通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移[2]。微小RNA（microRNA）具有促癌或抑癌作用，miR-520e 在膠質(zhì)瘤、肝癌以及非小細(xì)胞肺癌中具有抑癌作用[3-5]。星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤上調(diào)基因1（AEG-1）是調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的關(guān)鍵因子。研究[6]發(fā)現(xiàn)，AEG-1 在結(jié)腸癌中高表達(dá)，而miR-520e 可靶向作用于AEG-1，抑制其表達(dá)活性。本研究探討OMT 是否能調(diào)節(jié)miR-520e 從而降低AEG-1 表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器 OMT 購自美國Sigma 公司；si-NC、miR-520e inhibitor 和miR-520e mimic 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；5-氟尿嘧啶購自北京索萊寶科技有限公司；MTT 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；兔抗人AEG-1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（signal trans ducers and activators of transcription 3，STAT3）和 白 介 素6（interleukin-6，IL-6）抗體購自美國Abcam 公司；全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每2 天更換1 次培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度80%以上時進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳至第4 代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.4 MTT 法檢測不同濃度OMT 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響 將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，1×105個細(xì)胞/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后，將細(xì)胞隨機(jī)分為OMT 不同濃度組以及陽性對照組，用含不同濃度的OMT（0、10、30、50、70、90 μmol/L）培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，陽性對照組用50 μmol/L 的5-氟尿嘧啶培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩混勻，置于酶標(biāo)儀上測定490 nm 波長處的吸光度（A）值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組A 值/對照組A 值）×100%。

1.5 不同藥物處理對結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的影響 將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，1×105個細(xì)胞/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組（Control 組）、OMT組、陰性對照組（NC 組）、miR-520e 抑制物組（miR-520e inhibitor 組）和OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設(shè)置5 個復(fù)孔。70 μmol/L OMT 對細(xì)胞的抑制率接近于陽性對照組，故后續(xù)實驗采用70 μmol/L OMT。根據(jù)LipofectaminTM2000 說明書，NC 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照片段24 h，miR-520e inhibitor 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520e抑制物24 h，OMT+miR-520 e inhibitor 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520e 抑制物24 h 后，更換為含70 μmol/L OMT 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，按照1.4 的實驗方法計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實驗組A 值/對照組A 值×100%。

1.6 qRT-PCR 檢測細(xì)胞中miR-520e 的表達(dá)水平 對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520e inhibitor 組、OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，按照1.5的處理方法進(jìn)行處理，24 h后，收集各組細(xì)胞，Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，以U6為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，0.5 μL 上游引物和0.5 μL 下游引物，cDNA 1 μL，無核酶水8 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行40 個循環(huán)，采用2-△△CT計算miR-520e表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520e inhibitor 組、OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，按照1.5 的處理方法進(jìn)行處理，用100 μL 無菌槍頭均勻劃線，PBS 洗去細(xì)胞碎片，分別在劃線0 h和24 h，顯微鏡下觀察并拍照，Image Pro plus 6.0 軟件分析劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1.8 Transwell 實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520e inhibitor 組、OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，按照1.5 的處理方法進(jìn)行處理。將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，經(jīng)Matrigel 膠包被的Transwell 小室的上室中加入200 μL 單細(xì)胞懸液，下室中加入DMEM 培養(yǎng)基500 μL，24 h 后進(jìn)行多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照，計算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.9 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-520e 與AEG-1 的靶向關(guān)系 TargetScan 軟件預(yù)測miR-520e 與AEG-1 的3’UTR 具有結(jié)合位點，構(gòu)建野生型AEG-1 熒光素酶表達(dá)載體（WT-AEG-1）和突變型AEG-1 熒光素酶表達(dá)載體（Mut-AEG-1），采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將miRNC 和miR-520e mimic 共轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞中，以海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值代表miR-520e 與AEG-1 的結(jié)合強(qiáng)度。

1.10 蛋白印跡法檢測AEG-1、IL-6 和p-STAT3 蛋白相對表達(dá)量 對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520 e inhibitor 組以及OMT+miR-520 e inhibitor 組，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，按照1.5 的處理方法進(jìn)行處理。收集細(xì)胞，加入裂解液裂解30 min，離心，取上清，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，煮沸。上樣，120 V 電泳1.5 h，0.3 A 濕轉(zhuǎn)2 h，TBST 洗膜5 次，室溫封閉1 h，GAPDH、AEG-1、IL-6d、p-STAT3 和STAT3 一抗（1:1000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，二抗（1:5000）室溫孵育1 h，ECL 顯色，Image J 分析條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，2 組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較（，n =5）%

表2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較（，n =5）%

注：與10 μmol/L OMT 組比較，# P ＜0.05；與30 μmol/L OMT組比較，△P ＜0.05；與50 μmol/L OMT 組比較，▲P ＜0.05；與70 μmol/L OMT 組比較，□P ＜0.05；與90 μmol/L OMT 組比較，■P ＜0.05

2.2 各組細(xì)胞miR-520e 表達(dá)水平比較 見表3。

表3 各組細(xì)胞miR-520e 表達(dá)水平比較（，n =5）

表3 各組細(xì)胞miR-520e 表達(dá)水平比較（，n =5）

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

2.3 各組細(xì)胞存活率比較 見表4。

表4 各組細(xì)胞存活率比較（，n =5）%

表4 各組細(xì)胞存活率比較（，n =5）%

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□ P ＜0.05

2.4 各組細(xì)胞劃痕愈合率比較 見表5，圖1。

圖1 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

表5 各組細(xì)胞劃痕愈合率比較（，n =5）%

表5 各組細(xì)胞劃痕愈合率比較（，n =5）%

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

2.5 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較 見表6，圖2。

圖2 Transwell 實驗檢測細(xì)胞侵襲情況（×200）

表6 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較（，n =5）%

表6 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較（，n =5）%

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

2.6 熒光素酶報告基因檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染miR-520e mimic后，野生型AEG-1相對熒光素酶活性顯著降低，而突變型AEG-1相對熒光素酶活性無影響，見表7，圖3。

圖3 AEG-1 與miR-520e 結(jié)合位點與突變位點

表7 相對熒光素酶活性比較（，n =5）

表7 相對熒光素酶活性比較（，n =5）

2.7 各組細(xì)胞中AEG-1、IL-6 和STAT3 蛋白相對表達(dá)量比較 見表8，圖4。

圖4 細(xì)胞中各蛋白表達(dá)情況

表8 各組細(xì)胞中AEG-1、IL-6 和STAT3 蛋白相對表達(dá)量比較（，n =5）

表8 各組細(xì)胞中AEG-1、IL-6 和STAT3 蛋白相對表達(dá)量比較（，n =5）

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

3 討論

結(jié)腸癌具有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移能力，其惡性程度僅次于肺癌和乳腺癌，手術(shù)仍是治療結(jié)腸癌的常用手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高[7]。研究[8]表明，OMT 通過阻滯細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白，可抑制胰島素引起的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲。OMT 通過抑制程序性細(xì)胞死亡1 蛋白表達(dá)活性可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 對化療藥物順鉑的耐藥性[9]。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 為研究對象，探討OMT 對癌細(xì)胞惡性行為學(xué)的影響及其調(diào)控機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，隨著OMT 濃度的增加，細(xì)胞增殖活性逐漸降低，且具有劑量依賴性，表明OMT可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。miR-520e 被認(rèn)為是一種抑癌基因，在多種腫瘤中具有抑癌作用，在肺癌細(xì)胞A549中miR-520e 的表達(dá)明顯低于正常肺上皮細(xì)胞，miR-520e 過表達(dá)可降低癌細(xì)胞的遷移率、減少侵襲細(xì)胞數(shù)[10]。言成一等[11]研究表明，miR-520e 在非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞中低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-520e mimic 后可抑制癌細(xì)胞的增殖活性，降低癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，SW480 轉(zhuǎn)染miR-520e inhibitor 后，miR-520e 表達(dá)水平降低，與miR-520e inhibitor 組比較，OMT+mi R-520e inhibitor 組miR-520e 表達(dá)水平升高，可見OMT 可上調(diào)miR-520e 的表達(dá)。本研究通過MTT法實驗結(jié)果顯示，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組細(xì)胞存活率升高，與miR-520e inhibitor 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組細(xì)胞存活率降低，結(jié)果表明OMT 可上調(diào)miR-520e 表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖活性。劃痕實驗結(jié)果表明，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組劃痕愈合率降低，與miR-520e inhibitor組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組劃痕愈合率升高，表明OMT可上調(diào)miR-520e表達(dá)，降低癌細(xì)胞遷移能力。Transwell 實驗結(jié)果顯示，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組侵襲細(xì)胞數(shù)增多，與miR-520e inhibitor組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，表明OMT可上調(diào)miR-520e表達(dá)，降低癌細(xì)胞侵襲能力。

AEG-1 是一種公認(rèn)的促癌基因，在癌細(xì)胞的惡性生物行為學(xué)中發(fā)揮調(diào)控作用。研究[12]發(fā)現(xiàn)AEG-1 表達(dá)下調(diào)，可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對輻射的敏感性。研究[13]發(fā)現(xiàn)AEG-1 可促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌血管再生，因此AEG-1 可能成為治療舌鱗癌的潛在靶點。研究[14]報道AEG-1 通過上調(diào)eIF4E 的表達(dá)促進(jìn)胃癌的生長。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移的重要原因之一，IL-6 是微環(huán)境中其主要作用的炎性細(xì)胞因子，而STAT3 是重要的轉(zhuǎn)錄活性因子，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的作用。當(dāng)IL-6 與其受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)下游特定的酪氨酸殘基磷酸化，激活STAT3 發(fā)生磷酸化形成二聚體，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與靶基因的特定位點結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中p-STAT3 表達(dá)升高，IL-6 可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中STAT3 發(fā)生磷酸化，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。研究[17]發(fā)現(xiàn)茶多糖通過抑制IL-6/STAT3 途徑抑制結(jié)腸炎相關(guān)的大腸癌。研究[18]表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中下調(diào)AEG-1 表達(dá)，可通過抑制IL-6/STAT3 信號通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、降低癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，OMT 組AEG-1、IL-6 和p-STAT3 蛋白相對表達(dá)量低于Control 組，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor組AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量升高，與miR-520e inhibitor 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組AEG-1、IL-6 和p-STAT3 蛋白相對表達(dá)量降低，結(jié)果表明OMT 可上調(diào)miR-520e抑制AEG-1/IL-6/STAT3 信號通路。

綜上所述，OMT 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，降低癌細(xì)胞遷移和清洗能力，可能是通過上調(diào)miR-520e 抑制AEG-1 蛋白表達(dá)發(fā)揮作用。