羅 瑋，劉 玲，戴麗星，曾 華

（1.江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，武漢 430030；2.湖北省中醫(yī)院 腦病科，武漢 430000；3.武漢市中醫(yī)醫(yī)院 肛腸科，武漢 430000）

卒中后認(rèn)知功能障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是卒中后常見的認(rèn)知障礙類型，包括從卒中后認(rèn)知障礙非癡呆到卒中后癡呆的不同程度的認(rèn)知障礙[1]，給卒中后患者的日常生活、社會(huì)能力等方面造成嚴(yán)重影響[2]。PSCI 的早期評(píng)估、診斷和治療尤為重要，其中外周血血清中的一些生物標(biāo)志物與PSCI 的診斷具有相關(guān)性[3]。加味滌痰湯是本研究團(tuán)隊(duì)前期重點(diǎn)研究的方藥，并已證實(shí)該方具有明顯改善PSCI 患者認(rèn)知功能和日常生活能力的作用。本研究通過觀察加味滌痰湯對(duì)PSCI 患者血清miRNAs 表達(dá)的影響，探討加味滌痰湯的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020 年5 月－2021 年1 月在江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院住院患者及門診患者作為觀察病例，共30例。男13例，女17例；年齡50～75 歲，平均（65.64±5.63）歲；受教育年限6～16年，平均（10.48±2.18）年。另收集同期認(rèn)知功能正常的健康體檢者30例為對(duì)照組，男14例，女16例，年齡50～75 歲，平均（63.95±4.78）歲，受教育年限6～16 年，平均（10.88±2.79）年。2 組性別、年齡、受教育年限等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[4]（2010 年版）和《血管性認(rèn)知障礙診治指南》（2011 年版）中VCl 的診斷建議[5]擬定。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照血管性癡呆（VD）的中醫(yī)辨證量表（SDSVD）[6]擬定，證型為痰濁阻竅型。主癥：智力減退、思維遲鈍、表情淡漠或神情呆滯、口多痰涎、頭昏頭重、體胖臃腫、舌胖大或有齒痕、脈滑或濡等。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）年齡≥40 歲；2）符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程2 周～6 個(gè)月；3）符合中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；4）符合腦卒中后輕度認(rèn)知障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)，MoCA 量表評(píng)分＜26 分，CDR 評(píng)分＜0.5 分；5）意識(shí)清楚，具備視覺、聽覺分辨力，能接受神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試；6）知情同意本研究。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）其他疾病所致的認(rèn)知障礙；2）長期服用治療認(rèn)知功能障礙的藥物或其他藥物而影響療效評(píng)價(jià)者；3）已知的對(duì)于中藥組方成分過敏者；4）合并嚴(yán)重胃、十二指腸疾病影響藥物吸收者。

1.3 治療方法 PSCI 治療組均接受基礎(chǔ)治療，輔以心理疏導(dǎo)，幫助調(diào)節(jié)不良情緒。治療組均給予加味滌痰湯治療，方藥組成：茯苓15 g，制半夏、制南星、橘紅、炒枳實(shí)、竹茹、人參、丹參、川芎各10 g，石菖蒲、生姜、炙甘草各6 g，水煎服，每日200 mL，觀察時(shí)間為8 周，方藥隨證加減，在治療期間避免服用其他益智類藥物。

1.4 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.4.1 確立目標(biāo)miRNAs 組合 1）總RNA 提取及檢測(cè)；2）高通量測(cè)序；3）數(shù)據(jù)預(yù)處理：從測(cè)序得到的Raw data 中過濾出目標(biāo)片段，統(tǒng)計(jì)miRNA 的種類及數(shù)量，并對(duì)小RNA 做長度分布統(tǒng)計(jì)；4）數(shù)據(jù)分析：基因組對(duì)比，對(duì)已知miRNA 的鑒定和表達(dá)量分析，使用DEGseq 軟件進(jìn)行miRNA 表達(dá)差異分析。5）對(duì)已知miRNA 以及新miRNA 預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行KEGG和GO 功能注釋，進(jìn)一步篩選出功能性差異miRNAs為目標(biāo)miRNAs 組合。

1.4.2 血清miRNAs 檢測(cè) 取清晨空腹外周靜脈血各5 mL，室內(nèi)靜置后，血標(biāo)本自然凝固，再以13.5 cm的離心半徑，3 500 r/min 速度離心20 min，得到分離后的血清樣本。采用熒光定量PCR 法檢測(cè)血清目標(biāo)miRNAs 水平，PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。檢測(cè)步驟：1）總RNA 的提取，使用血清miRNA 提取分離試劑盒說明書提取血清中總miRNAs，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）總RNA 中DNase1 的消除，在37℃，30 min；Hold，加1 μL 的EDTA；65℃，10 min，得到總RNA 中DNA 的消除。反轉(zhuǎn)錄，RNA中基因組DNA 消除并除去DNase1 后，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?）Real-time PCR 擴(kuò)增，將制備好的cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：qbase plus。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序樣本總RNA 質(zhì)量檢測(cè) 對(duì)3例腦卒中后無認(rèn)知障礙者、3例PSCI 患者、3例健康人血清共9 個(gè)樣本進(jìn)行miRNA 高通量測(cè)序，分別提取血清總RNA，3 組樣本分別為PSCI-K 組、PSCI-P 組和Control 組。各樣本RNA 質(zhì)量及濃度檢測(cè)見表1，9個(gè)樣本的RNA 質(zhì)量及濃度均符合miRNA 高通量測(cè)序建庫標(biāo)準(zhǔn)。

表1 樣本總RNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 將測(cè)序得到的raw data 進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理得到clean data。9 個(gè)樣本中的Clean data 數(shù)均占raw data 數(shù)的80%以上，見表2。

表2 所有樣本Small RNA clean 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 差異miRNAs 篩選 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在腦卒中（無認(rèn)知障礙）患者中共有40 個(gè)差異miRNAs（19 個(gè)上調(diào)，21 個(gè)下調(diào)），在PSCI 患者中共有43 個(gè)差異miRNAs（21 個(gè)上調(diào)，22 個(gè)下調(diào)）。使用維恩圖統(tǒng)計(jì)2 個(gè)對(duì)比組共有的差異miRNAs，發(fā)現(xiàn)有20 個(gè)共同的差異miRNAs，結(jié)合差異miRNAs 功能分析結(jié)果，本研究挑選miR-31，miR-93，miR-143，miR-146a，miR-107，miR-222，let-7g，miR-126，miR-29a，miRNA-34a 作為目標(biāo)miRNAs 組合進(jìn)行研究。

2.4 PSCI 組治療前與對(duì)照組血清miRNAs 比較 PSCI組治療前，較對(duì)照組血清miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126表達(dá)明顯升高（P＜0.05），miR-29a，miRNA-34a表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 PSCI 組治療前與對(duì)照組血清miRNAs 比較（n =30）

2.5 PSCI 組治療前后血清miRNAs 比較 與治療前比較，PSCI 組治療后血清miR-29a、miRNA-34a 表達(dá)明顯升高（P＜0.05），miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-126 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），miR-107 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 PSCI 組治療前后血清miRNAs 比較（n =30）

3 討論

卒中后認(rèn)知障礙與卒中有著共同的發(fā)病機(jī)制，本研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，PSCI 中醫(yī)證型與篩選出的miRNAs 有著對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此miRNAs 組合的表達(dá)情況可能為早期診斷PSCI 及加味滌痰湯的干預(yù)作用提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，PSCI 組治療前血清miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126 表達(dá)明顯升高（P＜0.05），miR-29a，miRNA-34a 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），這與多篇文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。其中，雖然可見血清miR-222 表達(dá)水平升高，let-7 g表達(dá)降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與部分文獻(xiàn)結(jié)果不一致[7-8]。

miR-31 被稱為BCL6 的靶標(biāo)，可以通過抑制PKD1 表達(dá)來減少細(xì)胞損傷，miR-31 下調(diào)使IS 小鼠的腦梗死面積和氧化應(yīng)激水平顯著降低，可能與改善PSCI 有關(guān)[9]。miR-93 在急性IS 中具有診斷和預(yù)測(cè)潛力，并且可能通過靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖而參與炎癥反應(yīng)[10]。miR-93 拮抗劑可減輕過氧化氫誘導(dǎo)的損傷，抑制皮質(zhì)神經(jīng)元，miR-93 的下調(diào)發(fā)揮miR-93 拮抗劑誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用，減輕卒中后的缺血性損傷及認(rèn)知損害[11]。miR-143 參與神經(jīng)誘導(dǎo)保護(hù)，中風(fēng)誘導(dǎo)miR-143 上調(diào)，阻止了RLIP 誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)和HIF1-α 過表達(dá)[12]。miR-146a 在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中呈現(xiàn)顯著上調(diào)，與相關(guān)研究一致，miR-146a 在腦卒中急性期呈現(xiàn)下調(diào)，而在亞急性期呈現(xiàn)上調(diào)[13]。miR-146a（rs2910164）可以用作中風(fēng)預(yù)后的診斷標(biāo)志物，而該位點(diǎn)被認(rèn)為與認(rèn)知障礙有關(guān)[14]。miR-146a 在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的Toll 樣受體耐受中起主要作用，參與改變炎癥性認(rèn)知障礙風(fēng)險(xiǎn)基因表達(dá)的作用[15]。miR-107 的水平在IS 患者中顯著增加，與中風(fēng)的程度呈正相關(guān)[16]。miR-126 的表達(dá)水平與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)，對(duì)于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后非常有價(jià)值[17]。體內(nèi)缺血后miR-126 表達(dá)降低，能顯著降低氧葡萄糖剝奪和復(fù)氧（OGD/R）觸發(fā)的凋亡，競(jìng)爭性內(nèi)源RNA 直接與miR-126 結(jié)合，調(diào)節(jié)缺血性神經(jīng)元死亡，減輕神經(jīng)功能障礙[18]。中風(fēng)后給予miR-126 外泌體可改善功能恢復(fù)，增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生，抑制神經(jīng)炎癥[19]。miR-126 和miR-143 可能同時(shí)參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，且兩者與動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度相關(guān)，被認(rèn)為可能是特異性生物標(biāo)志物[20]。miR-29a 在抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖同時(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]，miR-29a 過表達(dá)可促進(jìn)大鼠腦出血后軸突的再生長出，改善神經(jīng)行為和認(rèn)知障礙，減輕神經(jīng)元損傷和線粒體功能障礙，并促進(jìn)神經(jīng)元中的神經(jīng)突向外生長[22]。miR-34a 呈現(xiàn)顯著下調(diào)，可作為生物標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[23]。miRNA-34a 通過調(diào)節(jié)Notch 信號(hào)傳導(dǎo)參與細(xì)胞凋亡，其抑制劑可降低動(dòng)作電位的頻率，激活Notch信號(hào)傳導(dǎo)并防止神經(jīng)元凋亡[24]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除APP/PS1 小鼠中的miR-34a 可顯著降低行為功能障礙[25]。

PSCI 屬中醫(yī)學(xué)的“健忘”“呆病”“郁證”范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為，PSCI 的病機(jī)特點(diǎn)為正氣內(nèi)虛，痰、瘀等實(shí)邪阻滯，治療應(yīng)為溫陽補(bǔ)氣、開竅醒神、化痰通絡(luò)、活血化瘀為主[26]。加味滌痰湯出自南宋嚴(yán)用和《濟(jì)生方》的經(jīng)方滌痰湯，化裁后具有益氣祛痰、化濁開竅的療效。本方橘紅、半夏、天南星、茯苓健脾安神、化痰理氣，枳實(shí)、竹茹化痰消痞、清熱化瘀，人參大補(bǔ)元?dú)?、益智安神，石菖蒲寧心開竅、化濕和胃，川芎、丹參行氣止痛，生姜、甘草調(diào)和全方，全方共奏健脾化痰、益氣活血、醒腦開竅之功。加味滌痰湯可通過提高皮質(zhì)乙酰膽堿水平，調(diào)控模型大鼠皮質(zhì)谷氨酸水平，增加大鼠海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，改善血管性輕度認(rèn)知功能障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，以及降低模型大鼠腦皮質(zhì)IL-6、TNF-α、NO 的含量及NOS 活性，起到神經(jīng)保護(hù)作用[27-28]。

綜上所述，miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126 及miR-29a、miRNA-34a 表達(dá)水平可能有助于PSCI 患者的早期診斷，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來驗(yàn)證；加味滌痰湯能升高PSCI 患者外周血血清miR-29a、miRNA-34a 的水平，顯著降低miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-126 的水平，使miR-107的水平降低，推測(cè)加味滌痰湯可能通過參與卒中后的炎癥反應(yīng)、改善動(dòng)脈粥樣硬化、參與神經(jīng)保護(hù)及認(rèn)知功能的改善而發(fā)揮治療PSCI 的作用，其詳細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制還需要更深入的研究。