陳麗娟， 張家友， 韓少玲， 吳 晶， 陳園園， 代明輝

(1.成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院/核工業(yè)四一六醫(yī)院， 四川 成都 610051 2.四川省綿陽市第三人民醫(yī)院血液科， 四川 綿陽 621000)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種血液系統(tǒng)原發(fā)性的漿細(xì)胞性腫瘤，是血液系統(tǒng)中僅次于淋巴瘤發(fā)生率排名第二的惡性腫瘤，據(jù)研究報告顯示，2016年我國MM患者的發(fā)病率約為1.03/10萬人口左右[1]。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的骨痛、繼發(fā)性貧血、腎功能損傷和感染等，嚴(yán)重影響患者生存水平。而且MM患者骨髓瘤細(xì)胞可以合成大量單克隆免疫球蛋白，抑制機(jī)體正常免疫球蛋白的合成，使得患者免疫功能受到損傷導(dǎo)致免疫力下降，引發(fā)侵襲性真菌感染(Invasive Fungal Infections,IFI)，對患者的生命安全造成嚴(yán)重威脅。MM合并IFI患者常并發(fā)多種癥狀累及多個器官，加快疾病進(jìn)程，因此早期明確MM合并IFI患者疾病進(jìn)展相關(guān)指標(biāo)，對于判斷疾病預(yù)后有重要意義。外周血淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比(Lymphocyte-to-Monocyte Ratio,LMR)是可以反映機(jī)體免疫狀態(tài)的淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞的比值，其表達(dá)與患者免疫系統(tǒng)與腫瘤誘導(dǎo)免疫功能障礙有關(guān)[2]。淋巴細(xì)胞亞群主要包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及NK淋巴細(xì)胞等，其中分別以CD3+、CD19+和CD16+56+較具代表性，其能夠參與免疫應(yīng)答，與MM的起病和進(jìn)展關(guān)系密切[3]。當(dāng)前臨床對于MM合并IFI的患者診斷主要是通過病理學(xué)、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室等檢查進(jìn)行確診，未明確準(zhǔn)確度高、檢測便捷和操作相對簡單的指標(biāo)從而對患者預(yù)后進(jìn)行判斷，本研究將分析LMR和CD3+、CD19+和CD16+56+水平在MM合并IFI患者中的表達(dá)及其意義，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2016年1月至2018年3月我院收治的MM合并IFI患者105例作為研究對象，選擇MM未合并IFI的患者98例作為對照組。依據(jù)Durie-Salmon分期[4](DS分期)分為Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ期59例。DS分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期(符合下列4項)：血紅蛋白>100g/L；血清鈣正?！?.0mmoL/L；骨骼X線示結(jié)構(gòu)正?；蚬铝⑿怨菨{細(xì)胞瘤；低M蛋白量：免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)<50g/L，免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)<30g/L，24h尿液中本周氏蛋白<4g。Ⅱ期：不符合Ⅰ～期和Ⅲ期的患者。Ⅲ期(符合任意一項或以上)：血紅蛋白<85g/L；血清鈣>3.0mmoL/L；骨骼X線示溶骨性病灶超過3個；高M(jìn)蛋白量：IgG>70g/L，IgA>50g/L，24h尿液中本周氏蛋白>12g。診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》中關(guān)于MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：①M(fèi)M的診斷：癥狀性MM：骨髓組織活檢測存在漿細(xì)胞瘤或者骨髓中單克隆漿細(xì)胞的比例超過10%；采用瓊脂糖凝膠免疫固定電泳技術(shù)在尿液或血液中檢測出克隆性免疫球蛋白且伴有組織和器官的損害。無癥狀MM：單克隆性免疫球蛋白大于等于30g/L或者骨髓克隆性的漿細(xì)胞比重大于等于10%。②IFI的診斷：參照2013年發(fā)布的血液病/惡性腫瘤IFI診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(第四次修訂版)[6]中診斷依據(jù)：在通常無菌而臨床表現(xiàn)或放射學(xué)檢查存在感染的部位病理學(xué)檢查呈陽性，且在無菌條件下取得的標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果呈陽性或(和)腦脊液經(jīng)鏡檢出現(xiàn)隱球菌呈陽性，血液真菌培養(yǎng)呈念珠菌、霉菌或酵母菌陽性且具有感染的癥狀體征。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診患者；②既往未發(fā)生真菌感染者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他血液系統(tǒng)疾病或代謝性疾??；②合并多個系統(tǒng)器官疾患；③免疫功能障礙或其他感染性疾病。觀察組和對照組患者年齡、性別、M蛋白分型[IgA，IgG，免疫球蛋白D型(Immunoglobulin D，IgD，輕鏈型]和Durie-Salmon分期(DS分期)資料比較差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 觀察組與對照組一般資料比較

1.2方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述各組外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)和單核細(xì)胞計數(shù)，計算LMR，測定患者的CD3+、CD19+和CD16+56+水平。具體操作如下：①采集各組患者和健康人晨起空腹靜脈血5mL，分別置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管和生化管中備用。②分別將兩支流式試管編號為a和b，然后各加入熒光抗體各10μL。③將抗凝血置于室溫平衡6h后輕輕搖勻，反向加樣將50μL全血加入試管內(nèi)，避光在室溫下保存放置15min；取出試管，每管加10倍的稀釋液450μL，混勻。④將試管避光靜置10min，待管內(nèi)液體澄清透亮后在4℃避光，然后使用流式細(xì)胞儀(深圳市默賽爾生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司，邁瑞B(yǎng)riCyte E6P)測定。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計數(shù)數(shù)據(jù)用構(gòu)成比表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性使用Spreaman等級相關(guān)性分析法，用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)、曲線下面積(Area under the Curve，AUC)、靈敏度、特異度分析各因子對MM合并IFI患者DS分期和預(yù)后的診斷及預(yù)測價值，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1MM合并IFI患者LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平的表達(dá)：觀察組患者外周血LMR和CD19+、CD16+56+較對照組均降低，且CD3+較對照組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 MM合并IFI患者LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平的表達(dá)

2.2DS不同分期MM合并IFI患者血清LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平的表達(dá)：DS分期Ⅲ期患者LMR和CD19+、CD16+56+均較Ⅰ～Ⅱ期降低，CD3+顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ期MM合并IFI患者LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平表達(dá)

2.3外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平與MM合并IFI患者DS分期的關(guān)系：運(yùn)用Speraman等級相關(guān)性分析方法，結(jié)果顯示：外周血LMR、CD19+和CD16+56+水平與MM合并IFI患者DS分期呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.686、-0.659、-0.661，P<0.01)，CD3+與DS分期呈正相關(guān)(rs=0.551，P<0.01)。

2.4外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平對MM合并IFI患者DS分期的診斷價值：經(jīng)過ROC曲線分析，外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導(dǎo)MM合并IFI患者DSⅠ～Ⅱ與Ⅲ期的分期均有較高效能，LMR≤6.14時診斷MM合并IFI患者DS分期為Ⅲ期的效能最高，敏感度和特異度分別為91.53%和89.13%。見表4和圖1。

圖1 外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導(dǎo)MM合并IFI患者DSⅠ～Ⅱ期與Ⅲ期的ROC曲線圖

表4 LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平指導(dǎo)MM合并IFI患者DS的ROC分析

2.5MM合并IFI生存組和死亡組患者外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平表達(dá)：死亡患者外周血LMR、CD19+和CD16+56+水平均低于存活組，CD3+水平高于存活組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 MM合并IFI生存與死亡組患者外周血LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平表達(dá)比較

2.6外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平對MM合并IFI患者結(jié)局的預(yù)測價值：經(jīng)過ROC曲線分析，外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導(dǎo)MM合并IFI患者預(yù)后均有較高效能，LMR≤4.02時預(yù)測MM合并IFI患者死亡的效能較高，其敏感度和特異度分別為79.56%和88.42%。見表6和圖2。

表6 LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平指導(dǎo)MM合并IFI患者預(yù)后的ROC分析

圖2 外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導(dǎo)MM合并IFI患者生存與死亡預(yù)后評估的ROC曲線圖

3 討 論

MM屬于一種漿細(xì)胞惡性增殖性的血液系統(tǒng)疾病，患者的體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能均會受到影響，容易導(dǎo)致支氣管、肺部等部位遭受真菌的侵襲，而出現(xiàn)氣道黏膜炎癥、壞死性肺炎等，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[7]。MM合并IFI患者病情進(jìn)展迅速，早期及時診治可以有效改善患者的預(yù)后，延緩疾病進(jìn)展，延長患者的生存時間。國外研究[8]發(fā)現(xiàn)MM患者在疾病進(jìn)展過程中體內(nèi)免疫系統(tǒng)存在缺陷，其中主要包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞亞群中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK淋巴細(xì)胞等的功能缺陷或數(shù)量異常。據(jù)蒙沙等[9]人的研究也證實(shí)低外周血淋巴細(xì)胞和低LMR是MM患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素。在既往研究基礎(chǔ)上，本研究分析了MM合并IFI患者外周血LMR和淋巴細(xì)胞亞群水平的變化，而且明確了上述因子與MM合并IFI患者DS分期進(jìn)展的關(guān)系，能夠在早期指導(dǎo)患者病情的判斷，從而指導(dǎo)臨床治療改善預(yù)后。

本研究數(shù)據(jù)顯示，觀察組患者外周血LMR和CD19+較對照組均顯著降低，且CD3+和CD16+56+均較對照組顯著升高，說明LMR和T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及NK淋巴細(xì)胞參與了疾病的發(fā)生和進(jìn)展。分析原因?yàn)長MR作為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比值，能夠反映患者免疫功能受損和障礙的程度，據(jù)袁茂林等[10]的研究報道已經(jīng)證實(shí)患者病情進(jìn)展與腫瘤免疫微環(huán)境關(guān)系密切，而且LMR也被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌患者的臨床分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與本研究的方向一致，但本研究明確了MM合并IFI患者外周血LMR較正常健康人水平明顯降低；T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞屬于特異性免疫細(xì)胞，而NK淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞等為固有免疫細(xì)胞，腫瘤患者體內(nèi)的抗腫瘤免疫應(yīng)答主要是由T淋巴細(xì)胞進(jìn)行介導(dǎo)從而維持機(jī)體免疫穩(wěn)定；而B淋巴細(xì)胞可以通過中和、調(diào)理和激活補(bǔ)體的方式介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，其還可以給淋巴T細(xì)胞加工提供可溶性抗原。而活化的B細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，CD56作為來源于造血干細(xì)胞NK淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志物，其可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞和已經(jīng)被感染的細(xì)胞，當(dāng)MM發(fā)生且集體感染嚴(yán)重時外周血NK細(xì)胞基數(shù)下降。因此，MM合并IFI患者存在體液免疫功能低下和免疫調(diào)節(jié)功能障礙，外周血LMR和CD19+、CD16+56+顯著降低，且CD3+升高。

上述研究數(shù)據(jù)還顯示，MM合并IFI患者DS分期重度患者的LMR和CD19+、CD16+56+均低于輕中度組，CD3+高于對照組，而且LMR和CD19+、CD16+56+水平與MM合并IFI患者DS分期呈負(fù)相關(guān)，CD3+與DS分期呈正相關(guān)，說明LMR和淋巴細(xì)胞亞群與MM合并IFI患者疾病進(jìn)展密切相關(guān)。分析原因?yàn)榱馨图?xì)胞對于宿主抗腫瘤和抗感染的防御有重要作用，淋巴細(xì)胞計數(shù)降低的患者可能使得對惡性腫瘤的免疫反應(yīng)減弱從而加快腫瘤細(xì)胞的增殖，加重疾病進(jìn)展。桂前樂等[11]關(guān)于腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞在MM中的浸潤及其臨床意義的研究中提出，骨髓微環(huán)境中的單核細(xì)胞能夠抑制宿主抗腫瘤的免疫力和促進(jìn)腫瘤血管的生成，而且分化成的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor Associated Macrophages,TAM)可以通過支持血管的生成以促進(jìn)腫瘤生長而且還能通過誘導(dǎo)免疫抑制保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡，骨髓微環(huán)境中的TAM與MM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此當(dāng)淋巴細(xì)胞低表達(dá)且單核細(xì)胞增多時，LMR值降低并且反映宿主抑制腫瘤的功能降低，進(jìn)而加重MM合并IFI患者疾病進(jìn)展，使患者預(yù)后不良。淋巴細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞表面分化群可以分為CD3+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞以及CD16+56+NK淋巴細(xì)胞等，而CD3+又可分為CD4+輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞和CD3+CD8+T即CD8+抑制、殺傷T細(xì)胞(即Th細(xì)胞、Ts細(xì)胞)，上述淋巴細(xì)胞亞群相互協(xié)作相互制約從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制，維持機(jī)體免疫平衡。袁中健等[12]的研究顯示，MM患者體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答主要由T細(xì)胞發(fā)揮作用，其中CD3+中Th細(xì)胞是免疫應(yīng)答中的主要反應(yīng)細(xì)胞，Th相關(guān)細(xì)胞因子的異常表達(dá)參與了MM的發(fā)生發(fā)展，這也說明了CD3+的升高與MM的進(jìn)展關(guān)系密切，這與本研究中CD3+與DS分期呈正相關(guān)結(jié)果一致。而CD8+T細(xì)胞是由抑制性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞組成，然后對靶細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此，CD3+的升高反映T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能受到抑制，從而減輕了其對骨髓中漿細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致漿細(xì)胞的進(jìn)一步增殖加重病情?；罨腂細(xì)胞可以分泌多種因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，本研究中MM患者CD19+水平降低，說明隨著DS分期的加重，患者體液免疫功能進(jìn)一步受到抑制，這與既往研究證實(shí)的B淋巴細(xì)胞通過誘導(dǎo)成熟蛋白-1的水平與MM預(yù)后呈負(fù)相關(guān)的觀點(diǎn)一致[13]。NK細(xì)胞能夠直接殺傷靶細(xì)胞從而發(fā)揮抗感染、抗腫瘤等作用，其隨著DS分期而逐漸降低反應(yīng)宿主抗腫瘤能力加重患者病情，導(dǎo)致不良預(yù)后。

據(jù)外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導(dǎo)MM合并IFI患者DS的ROC分析顯示，LMR對于指導(dǎo)鑒別MM合并IFI患者DS嚴(yán)重程度和生存與死亡的預(yù)后情況的效能更高，說明LMR變化可以用來提示患者病情進(jìn)展，并指導(dǎo)患者預(yù)后情況。分析原因?yàn)殡S著病原菌的進(jìn)一步侵蝕，淋巴細(xì)胞的耗竭會引起宿主免疫功能的持續(xù)下降，造成感染病原體無法及時清除造成機(jī)體免疫受損，而且淋巴細(xì)胞對于抗腫瘤和抗感染的作用十分重要，其水平一旦降低，便有利于腫瘤細(xì)胞的增殖；單核細(xì)胞分化而來的TAM可以改變腫瘤微環(huán)境同時釋放多種促血管生成細(xì)胞因子等進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和生長造成免疫抑制等，而且，王毅均等[14]研究表明TAM是判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后重要指標(biāo)，高TAM浸潤的患者預(yù)后較差，這與本研究的方向一致。所以作為淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比值的LMR對于機(jī)體免疫功能和疾病進(jìn)展具有明顯的指導(dǎo)價值，另外，Chen XQ等[15]的研究提出診斷時LMR升高的患者無進(jìn)展生存期和總生存期更長，認(rèn)為LMR比單純比較淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞能更好的反應(yīng)預(yù)后，這也與本研究的觀點(diǎn)一致。LMR可以同時反應(yīng)腫瘤微環(huán)境以及宿主當(dāng)前的免疫功能水平，更準(zhǔn)確地提示患者的預(yù)后信息。本研究數(shù)據(jù)還顯示，MM合并IFI死亡患者外周血LMR、CD19+和CD16+56+水平均顯著低于存活組，CD3+水平高于存活組，說明LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。分析原因?yàn)楫?dāng)具有抗腫瘤作用的淋巴細(xì)胞計數(shù)降低，而有分泌促腫瘤細(xì)胞生長的單核細(xì)胞計數(shù)增多時會導(dǎo)致LMR降低，隨著LMR的進(jìn)一步下降，宿主抑制腫瘤的功能減弱，加重MM合并IFI患者病情進(jìn)展；另外，隨著T淋巴細(xì)胞CD3+的升高、B淋巴細(xì)胞CD19+以及NK細(xì)胞CD16+56+的降低使得患者免疫功能低下，而且隨著真菌的入侵，會導(dǎo)致患者出現(xiàn)肺炎等并發(fā)癥以及多個器官的損傷乃至死亡，因此，LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

多發(fā)性骨髓瘤合并侵襲性真菌感染患者外周血LMR和CD19+、CD16+56+降低，CD3+升高，其與疾病進(jìn)展及預(yù)后均存在關(guān)聯(lián)，可以指導(dǎo)鑒別MM合并IFI患者的DS分期和預(yù)后。