陳錦成 朱國(guó)濤 秦曉飛 陳彥丞 羅駿 余博飛 吳宜璟 徐杰*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122

2.福建省立醫(yī)院骨二科，福建醫(yī)科大學(xué)，福建 福州350001

課題組前期利用Illuminanc高通量測(cè)序技術(shù)在肌少-骨質(zhì)疏松癥[1]患者和骨質(zhì)疏松癥患者的肌肉組織中檢測(cè)到了存在差異性表達(dá)的miRNA，其中肌少-骨質(zhì)疏松癥組中miR-381-3p呈10.57倍的上調(diào)表達(dá)，且經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證[2]，表明miR-381-3p可能參與肌少癥患者容易發(fā)生骨量丟失的病理過程[3]。通過利用TargetScan7.2軟件[4]對(duì)miR-381-3p 可能調(diào)控的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，綜合預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靶基因可能為ETS1。

MicroRNA是一類廣泛存在于真核生物當(dāng)中，長(zhǎng)度在21～23個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA[5]。成熟的miRNA 通過形成沉默復(fù)合體，再通過完全或不完全配對(duì)與特定靶基因的3’UTR結(jié)合，起到抑制mRNA翻譯或是直接降解mRNA的作用，從而影響了靶基因的表達(dá)水平[6]。據(jù)報(bào)道m(xù)iRNA在維持骨骼發(fā)育和新陳代謝方面起著至關(guān)重要的作用[7]。Elias等[8]發(fā)現(xiàn)ETS1屬于調(diào)控骨骼生成的轉(zhuǎn)錄因子；ETS1可存在于胞核內(nèi)，激活的ERK1/2二聚物可以直接刺激修飾ETS1，同時(shí)直接抑制修飾成脂分化特異性指標(biāo)PPARγ[9]；此外，ETS1可通過與許多骨基質(zhì)蛋白(ALP、Runx2、collagen I)基因DNA上特殊的調(diào)節(jié)區(qū)相結(jié)合，來激活并調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。Fan等[10]研究發(fā)現(xiàn)ETS1對(duì)骨組織的發(fā)育和成骨細(xì)胞的分化與成熟起重要的調(diào)控作用。唐乖等[11]通過miRNA 靶基因預(yù)測(cè)工具對(duì)hsa-miR-381-3p進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，miR-381-3p的靶基因集合顯著富集于MAPK、Wnt、P53 等信號(hào)通路中，這三者均是調(diào)控成骨分化的重要通路[12-13]，而ETS1屬于MAPK/ERK1/2信號(hào)通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子。綜上，本課題擬研究miR-381-3p是否通過調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路而抑制ETS1活性，最終影響MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化水平。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備見表1。

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備Table 1 Main experimental equipment

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑：主要實(shí)驗(yàn)試劑見表2。

表2 主要實(shí)驗(yàn)試劑Table 2 Main experimental compounds

1.1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：在中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫購買小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1 subclone14)細(xì)胞株 (批號(hào)：GNM15)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1構(gòu)建miR-381-3p過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)漢恒慢病毒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后換上2 μg/mL濃度的嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株。采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為NC mimic miR-381-3p組、mimic miR-381-3p組、NC inhibitor miR-381-3p組和inhibitor miR-381-3p組，隨后4組均進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化干預(yù)并檢測(cè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.2.2各組細(xì)胞中ALP的活性測(cè)定：用成骨誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)液 (50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松) 連續(xù)誘導(dǎo)干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞7 d，每72 h換液1次，收集各組細(xì)胞干預(yù)后的培養(yǎng)液，然后2 000 r/min，離心8 min取上清液進(jìn)行測(cè)定；向96孔板內(nèi)加50 μL基質(zhì)液、50 μL緩沖液和30 μL樣品，充分混勻37 ℃孵育15 min；添加150 μL顯色劑，輕輕振搖孔板混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)520 nm各孔的吸光度OD值；得到各組ALP活性原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后根據(jù)說明書中酶活性計(jì)算公式操作并統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.3各組細(xì)胞茜素紅染色(ARS)檢測(cè)：各組MC3T3-E1細(xì)胞血清饑餓24 h，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2周后，將各組細(xì)胞6孔板中的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液吸取干凈，用2 mL的1×PBS清洗2次；每個(gè)培養(yǎng)孔中加2 mL的4%中性甲醛溶液，室溫固定15 min后；中性甲醛溶液去除，用2 mL的1×PBS溶液清洗2次；每個(gè)培養(yǎng)孔中沿邊加2 mL茜素紅染液室溫避光染色15 min后；茜素紅染液去除干凈，再用2 mL的1×PBS緩慢沖洗3次減少染色背景干預(yù)；顯微鏡下觀察各組細(xì)胞成骨分化ARS染色情況并拍照記錄。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組細(xì)胞目的基因mRNA的表達(dá)水平：采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度質(zhì)檢；各組定量后根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書操作，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，反應(yīng)體系20 μL。ALP、Runx2、ETS1、PPARγ、miR-381-3p、內(nèi)參基因GAPDH和U6的引物序列及反應(yīng)條件見表3。按照下列條件進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)：①預(yù)變性條件 95 ℃，30 s 1個(gè)循環(huán)；②PCR反應(yīng)程序設(shè)置 95 ℃，5 s ；60 ℃ 30 s ，40個(gè)循環(huán)；③溶解曲線程序95 ℃，15 s ；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，以GAPDH作為內(nèi)參，每組復(fù)孔3個(gè)，域值循環(huán)數(shù)(CT)值取均數(shù)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用2-ΔΔCt算法對(duì)各組樣本目標(biāo)基因表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析，依據(jù)此數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與繪制柱狀圖。

表3 引物序列及反應(yīng)條件Table 3 Primer sequences and reaction condition

1.2.5各組細(xì)胞中ALP、collagen Ⅰ、Runx2、ETS1、PPARγ、P-ERK1/2蛋白表達(dá)的檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株按分組條件培養(yǎng)14 d后，用4 ℃預(yù)冷2 mL的PBS液清洗2次，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞上清液以獲得總蛋白，利用BCA蛋白定量法測(cè)定各組蛋白濃度，取5×蛋白上樣緩沖液與樣品渦旋混勻后金屬浴(99 ℃)煮沸10 min將蛋白變性。每個(gè)泳道20 μg蛋白樣品進(jìn)行上樣，10 %聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫?fù)u床封閉1 h，加入稀釋好的一抗，在4 ℃凍庫的搖床上孵育過夜，1×TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP二抗后室溫?fù)u床結(jié)合1 h，1×TBST清洗3次，每次5 min；加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑并用凝膠成像系統(tǒng)顯影，條帶用Image Lab 5.2軟件分析，目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值之比為校正后蛋白灰度值，并數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與繪制成柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MC3T3-E1細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染miR-381-3p熒光表達(dá)情況

MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因的病毒并篩選成穩(wěn)轉(zhuǎn)株后可在熒光顯微鏡觀測(cè)到GFP表達(dá)效率，圖1為4組MC3T3-E1細(xì)胞在顯微鏡明場(chǎng)和熒光顯微鏡下拍攝結(jié)果，可見4組細(xì)胞GFP熒光表達(dá)均較強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率較高。

2.2 MC3T3-E1細(xì)胞中miR-381-3p轉(zhuǎn)染效率qRT-PCR檢測(cè)

分別在4組MC3T3-E1細(xì)胞中感染對(duì)應(yīng)的病毒，經(jīng)過嘌呤霉素篩選后構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株，采用qRT-PCR檢測(cè)各組miR-381-3p的表達(dá)水平；NC mimic miR-381-3p組與mimic miR-381-3p組比較，差異倍數(shù)高達(dá)104.66倍(P<0.05)；NC inhibitor miR-381-3p組和inhibitor miR-381-3p組相比，差異倍數(shù)為0.74倍(P<0.05)，證明miR-381-3p表達(dá)水平被抑制；4組中miR-381-3p轉(zhuǎn)染效率經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證達(dá)到預(yù)期結(jié)果(圖2)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。

2.3 茜素紅染色(ARS)

各組MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14 d后，NC mimic miR-381-3p組和NC inhibitor miR-381-3p組經(jīng)ARS僅見少許散在的橘紅色鈣化結(jié)節(jié) (圖3A和3C)，mimic miR-381-3p組經(jīng)ARS未見形成具有代表性的橘紅色的鈣化結(jié)節(jié) (圖3B)；而inhibitor miR-381-3p組經(jīng)ARS細(xì)胞視野可見大片散在或連成一片分布于細(xì)胞表面的橘紅色經(jīng)典鈣結(jié)節(jié)(圖3 D)。4組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行定量分析并運(yùn)用GraphPad Prism8.4.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖4)。

2.4 堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力

誘導(dǎo)成骨分化干預(yù)7 d，與mimic miR-381-3p組相比，NC mimic miR-381-3p組可一定程度上調(diào)細(xì)胞ALP的活性(P<0.05)；與NC inhibitor miR-381-3p組對(duì)比，inhibitor miR-381-3p組顯著上調(diào)細(xì)胞ALP的活性(P<0.05)，見圖5。

2.5 各組細(xì)胞中ALP、Runx2、ETS1和PPARγ mRNA表達(dá)的比較

與mimic miR-381-3p組比較，NC mimic miR-381-3p組可上調(diào)ALP、Runx2、ETS1 mRNA表達(dá)水平，其中PPARγ mRNA的表達(dá)水平則被下調(diào)(P<0.05)；與NC inhibitor miR-381-3p組對(duì)比，inhibitor miR-381-3p組可顯著上調(diào)ALP、Runx2和ETS1 mRNA表達(dá)水平，而PPARγ mRNA的表達(dá)水平則被下調(diào)(圖6)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 各組細(xì)胞中ALP、collagen Ⅰ、Runx2、ETS1、PPARγ和P-ERK1/2蛋白表達(dá)比較

與mimic miR-381-3p組比較，NC mimic miR-381-3p組可上調(diào)ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平，其中PPARγ的蛋白表達(dá)水平則被下調(diào)(P<0.05)；與NC inhibitor miR-381-3p組對(duì)比，inhibitor miR-381-3p組可上調(diào)ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平，而PPARγ的蛋白表達(dá)水平則被顯著下調(diào)(P<0.05)(圖7)。當(dāng)使用MAPK信號(hào)通路的抑制劑PD98059后，與inhibitor+PD98059組和PD98059組對(duì)比，inhibitor組可顯著上調(diào)ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平，其中PPARγ的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)(圖8)。

3 討論

MC3T3-E1細(xì)胞具備定向成骨分化特性，是近年來體外研究成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)的較為成熟的細(xì)胞模型[14]。在本研究中運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)[15]，構(gòu)建miR-381-3p過表達(dá)與低表達(dá)細(xì)胞模型，并且在qRT-PCR與蛋白實(shí)驗(yàn)中證實(shí)miR-381-3p與EKR1/2/ETS1信號(hào)通路密切相關(guān)；當(dāng)miR-381-3p過表達(dá)時(shí)EKR1/2/ETS1信號(hào)因子在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化中受到一定程度的抑制，同時(shí)成脂分化特異性指標(biāo)PPARγ蛋白呈上調(diào)表達(dá)。miR-381-3p過表達(dá)通過下調(diào)生長(zhǎng)與分化的MAPK/ERK信號(hào)通路中的兩個(gè)重要靶基因EKR1/2/與ETS1表達(dá)，抑制了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化；此外，miR-381-3p與PPARγ的特異性結(jié)合并激活其表達(dá)，一定程度影響了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力。

Qi和Kim等[16-17]研究表明，MAPK/ERK通路的激活在許多細(xì)胞類型的成骨分化中起重要作用。本研究中當(dāng)miR-381-3p低表達(dá)時(shí)，細(xì)胞中Runx2、ALP、ETS1 mRNA和蛋白表達(dá)被上調(diào)以及下調(diào)PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)，并可上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性和礦化水平[18]；當(dāng)miR-381-3p過表達(dá)時(shí)，細(xì)胞中Runx2、ALP、collagen Ⅰ和ETS1及P-ERK1/2的蛋白表達(dá)均顯著降低，而PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平則是升高的，并且下調(diào)了MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性和礦化水平。Runx2、ALP、collagen Ⅰ和ETS1及P-ERK1/2都是與MAPK/ERK信號(hào)通路密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[19-20]；當(dāng)用研究中使用MAPK信號(hào)通路抑制劑PD98059一定程度抑制P-ERK1/2表達(dá)后，下游相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子活化水平同樣受到抑制。由此，證明了EKR1/2/ETS1信號(hào)因子密切參與miR-381-3p調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的過程。綜上研究數(shù)據(jù)和結(jié)合梳理相關(guān)文獻(xiàn)表明miR-381-3p的過表達(dá)可一定程度的下調(diào)EKR1/2/ETS1信號(hào)因子的表達(dá)，從而抑制了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力。

眾所周知，PPARγ作為MAPK/ERK1/2通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，其激活后可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化并抑制成骨細(xì)胞分化，在實(shí)驗(yàn)中我們揭示了過表達(dá)的miR-381-3p通過與PPARγ轉(zhuǎn)錄因子的3′UTR結(jié)合一定程度上抑制了P-ERK1/2與ETS1的表達(dá)。

miRNA在成骨代謝過程中主要發(fā)揮序列特異性轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用[21]，越來越多的研究表明miRNA參與各種細(xì)胞生理過程的調(diào)控，其中包括細(xì)胞增殖與分化及脂肪代謝等，還重點(diǎn)參與調(diào)控骨質(zhì)疏松癥、肌少-骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過程[22]。miRNA對(duì)成骨代謝調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，信號(hào)通路作為調(diào)控骨代謝的重要途徑，研究不同信號(hào)通路共同作用參與調(diào)節(jié)成骨代謝意義重大。以往研究更多是從miRNA直接調(diào)控或間接調(diào)控Wn通路因子活性與促進(jìn)成骨細(xì)胞分化等方面開展相關(guān)研究[23]。本研究首先從篩選出特異性miRNA，然后設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)基本闡明了miR-381-3p抑制MAPK/ERK1/2/ ETS1信號(hào)軸活性而下調(diào)成骨代謝水平的機(jī)制。本研究不僅豐富了miRNA調(diào)控信號(hào)通路影響成骨代謝內(nèi)容，還為后續(xù)相關(guān)miRNA結(jié)合MAPK信號(hào)通路研究成骨代謝提供了新思路和理論依據(jù)。