高偉靜 林朋朝

骨關(guān)節(jié)炎是一種多發(fā)于中老年的慢性骨關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨硬化增生、進行性退變等為主要臨床表現(xiàn)，其致殘率居世界疾病譜第4位，嚴重危害人類的生命健康和生活質(zhì)量[1]。骨關(guān)節(jié)炎好發(fā)于髖、膝、手等關(guān)節(jié)，以膝骨關(guān)節(jié)炎最為多見。骨關(guān)節(jié)炎病理機制復雜，其中軟骨細胞增殖障礙與過度凋亡在其進展過程中發(fā)揮著重要作用[2,3]。目前，臨床上對骨關(guān)節(jié)炎主要采用非甾體藥物抗炎、關(guān)節(jié)腔穿刺注射骨保護劑等對癥治療，雖能改善癥狀，但不能抑制骨關(guān)節(jié)炎進展，并且容易引發(fā)消化不良、出血等并發(fā)癥[4,5]。

黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是中藥黃芪的主要活性成分，由葡聚糖、葡萄糖、鼠李糖等組成，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理學作用[6～8]。Janus激酶2(janus kinase 2，JAK2)/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(aignal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路參與細胞增殖與凋亡的調(diào)控，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠通過JAK2/STAT3通路調(diào)控腎小管上皮細胞、口腔鱗癌細胞增殖與凋亡[10,11]。本研究旨在探討APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡以及JAK2/STAT3信號通路的影響，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1.材料：(1)細胞：取嚴重膝骨關(guān)節(jié)炎并行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，剪碎后滴加0.25%胰酶、2%Ⅱ型膠原酶后置37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中消化10h，4℃ 2000r/min離心(半徑8cm)5min取沉淀，DMEM培養(yǎng)基沖洗后再離心取沉淀，如此重復3次，即為膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理審批號：2020-SJZSY-KY-004)。(2)藥物與試劑：APS購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司；MTT試劑盒購自美國Amresco公司；PI、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司；BCA、ECL購自北京索萊寶科技有限公司；兔源JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin抗體和羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2.分組與給藥：取對數(shù)生長期人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞，設(shè)空白對照組，APS低、中、高劑量組和塞來昔布組。空白對照組接種于常規(guī)DMEM培養(yǎng)基；APS低、中、高劑量組分別接種于含終濃度25、50、100mg/L APS的DMEM培養(yǎng)基[12]；塞來昔布組接種于含終濃度20mg/L塞來昔布的DMEM培養(yǎng)基，48h后檢測各指標[13]。

3.MTT法檢測細胞增殖活力：各組細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后收集細胞，制備濃度6×105個/毫升的單細胞懸液，100微升/孔接種于96孔培養(yǎng)板，各組均設(shè)10個復孔。20微升/孔加入5mg/ml的 MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后收集細胞，200微升/孔加入DMSO 37℃避光孵育10min后，通過酶標儀檢測490nm波長處吸光度(A)值，細胞增殖活力(%)=[(A藥物組-A調(diào)零組)/(A空白對照組-A調(diào)零組)]×100%。

4.Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡水平：各組細胞經(jīng)不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集細胞，遵照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明，加入結(jié)合緩沖液重懸細胞后，滴加Annexin V-FITC和PI染液37℃避光孵育15min，然后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

5.PI染色法檢測細胞周期分布：每組取10個復孔，經(jīng)0.25%胰酶消化后收集細胞，75%的乙醇溶液固定12h，滴加PI溶液避光孵育30min后，通過流式細胞儀檢測細胞周期(G0/G1期、S期、G2/M期)分布。

6.Western blot法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達：每組取10個復孔，經(jīng)0.25%胰酶消化后收集細胞，加RIPA裂解液置于冰上裂解30min，4℃、12000r/min離心(半徑8cm)20min取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度、沸水浴10min使蛋白變性后，SDS-PAGE電泳分離蛋白、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2h后，滴加目標蛋白和β-actin一抗后4℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育1.5h，洗膜后滴加ECL顯色，以目標蛋白與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值的比值作為目標蛋白相對表達量。

結(jié) 果

1.APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活力和凋亡的影響：與空白對照組比較，APS中、高劑量組和塞來昔布組細胞增殖活力顯著升高、凋亡率顯著降低(P<0.01)；與塞來昔布組比較，APS高劑量組細胞增殖活力顯著升高、凋亡率顯著降低(P<0.05),詳見表1、圖1。

表1 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活力和凋亡率的影響

圖1 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

2.APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞周期分布的影響：與空白對照組比較，APS中、高劑量組和塞來昔布組處于G0/G1期細胞比例顯著降低、S期細胞比例顯著升高(P<0.05)；與塞來昔布組比較，APS高劑量組處于G0/G1期細胞比例顯著降低、S期細胞比例顯著升高(P<0.01)，詳見圖2、表2。

表2 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞周期分布的影響

圖2 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞周期分布的影響

3.APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響：與空白對照組比較，APS中、高劑量組和塞來昔布組p-JAK2、p-STAT3表達明顯上調(diào)(P<0.01)，JAK2、STAT3表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值顯著升高(P<0.01)；與塞來昔布組比較，APS高劑量組p-JAK2、p-STAT3表達明顯上調(diào)(P<0.01)，JAK2、STAT3表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值顯著升高(P<0.01)，詳見圖3、表3。

表3 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3相對表達量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值的影響

圖3 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響

4.APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響：與空白對照組比較，APS中、高劑量組和塞來昔布組cyclin D1、Bcl-2表達明顯上調(diào)而p21、cleaved caspase-3、Bax表達明顯下調(diào)(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.01)；與塞來昔布組比較，APS高劑量組cyclin D1表達明顯上調(diào)且p21、cleaved caspase-3、Bax表達明顯下調(diào)(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.01),詳見圖4、表4。

表4 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax相對表達量及Bcl-2/Bax比值的影響

圖4 APS對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

討 論

細胞增殖與凋亡過程均有多種蛋白參與調(diào)控。cyclin D1能夠激活周期素依賴性蛋白激酶(CDK)并誘導轉(zhuǎn)錄因子E2F表達，CDK和轉(zhuǎn)錄因子E2F則能夠促使細胞周期由G1期進入S期，從而縮短細胞周期、促進細胞增殖[14]。p21是CDK抑制劑，能夠與CDK形成p21-CDK復合物而抑制其活性，進而起到阻滯細胞周期進程的作用[15]。cleaved caspase-3能夠刺激啟動細胞凋亡并參與細胞凋亡執(zhí)行過程。Bax能夠誘導細胞色素C(Cyt C)釋放，Cyt C則能夠剪切活化caspase-3而間接促進細胞凋亡；Bcl-2能夠抑制Cyt C釋放，能夠與Bax形成二聚體而抑制Bax活性，表現(xiàn)為抑細胞凋亡作用，Bcl-2/Bax比值能夠反映二者對細胞凋亡的調(diào)控作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APS干預能夠明顯提高人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖活力并降低凋亡率；明顯提高處于G0/G1期細胞比例，上調(diào)cyclin D1、Bcl-2表達并下調(diào)p21、cleaved caspase-3、Bax表達，提高Bcl-2/Bax比值，這可能是APS促進人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖并抑制其凋亡的重要分子機制。

JAK是一類酪氨酸蛋白激酶，包括JAK1、JAK2、JAK3 3種亞型，其中JAK2介導配體和受體間信號的轉(zhuǎn)導；STAT蛋白有7種亞型，其中STAT3為JAK2的下游基因，能夠被p-JAK2誘導表達和磷酸化活化[17]。p-STAT3則能夠誘導cyclin D1、Bcl-2表達，因此JAK2/STAT3通路參與細胞增殖與凋亡過程的調(diào)控[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，APS干預能夠明顯上調(diào)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞p-JAK2、p-STAT3表達，提高p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值，提示APS能夠激活JAK2/ STAT3通路。

綜上所述，APS具有促進人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖并抑制其凋亡的作用，其機制可能與激活JAK2/ STAT3通路有關(guān)。本研究結(jié)果為APS做為膝骨關(guān)節(jié)炎治療備選藥物提供了理論支持。