＊陳玉煒 聶小安

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所 江蘇 210042 2.鹽城工學(xué)院 江蘇 224051）

1.前言

隨著時代的發(fā)展，全球工業(yè)化進程的不斷深入，能源需求量和化石燃料消耗量逐年增加?；剂系倪^度消耗會引發(fā)能源枯竭、環(huán)境污染、氣候變暖等危害，對人類的可持續(xù)發(fā)展造成不可逆轉(zhuǎn)的影響。使用可再生能源替代化石燃料可有效緩解大氣污染和能源危機，近些年受到學(xué)者的重視。其中，生物燃料因取材環(huán)保、價格低廉、工藝簡單等優(yōu)勢，近年來發(fā)展迅速。生物燃料以農(nóng)林廢棄物、生活垃圾、畜禽糞便等作為原料，直接或間接利用植物的光合作用，通過物理轉(zhuǎn)換、化學(xué)轉(zhuǎn)換、生物轉(zhuǎn)換等形式轉(zhuǎn)化為固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)燃料[1]。

經(jīng)過多年的發(fā)展，生物燃料已經(jīng)發(fā)展到第三代。第一代生物燃料利用小麥、玉米、大豆等作為原料，利用真菌菌絲發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇，或利用植物油脂生產(chǎn)生物柴油。第一代生物燃料雖然解決了能源問題，但是其原料來自于人類的糧食，且原料成本價格高昂，不宜大面積推廣使用。在此基礎(chǔ)上，學(xué)者們對生物燃料的原料進行優(yōu)化，形成了第二代生物燃料。常見的第二代生物燃料包括生物乙醇和生物柴油。第二代生物柴油對動植物油脂進行加氫脫氧、異構(gòu)等反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橹緹N類[2]；第二代生物燃料通常使用森林廢棄物、廢木屑和有機廢料生產(chǎn)生物乙醇。第二代生物燃料雖較第一代有較大改進，但從全生命周期來考察，能源利用率仍較低，對二氧化碳減排尚不明顯[3]。在兩代研究的基礎(chǔ)上，第三代生物燃料應(yīng)運而生。第三代生物柴油使用微生物在含碳的工農(nóng)業(yè)廢棄物中培養(yǎng)，使微生物體內(nèi)積累油脂，通過提取油脂便可制得生物柴油[4]。與前面兩代生物燃料相比，第三代生物燃料原料來源廣泛，微生物的光合作用消耗二氧化碳，對全球氣候變暖能起到緩解作用，應(yīng)用前景廣闊。

2.產(chǎn)油微生物菌體培育技術(shù)

微生物油脂（Microbial oils），又稱單細胞油脂（Single Cell Oil），是由微生物將有機物（如烴類、糖類、醇類等）或有機廢棄物（如秸稈水解物）作為碳源，并配合氮、磷、無機鹽等營養(yǎng)元素在特定條件下產(chǎn)生的物質(zhì)[5]。微生物中的油脂含量因微生物的種類、培養(yǎng)環(huán)境等不同而有差異，著名生物學(xué)家Ratledge把產(chǎn)油微生物定義為油脂積累量超過細胞總量20%的微生物。產(chǎn)油微生物通常包括細菌、微藻、霉菌、酵母等[6]。細菌僅積累一些特殊的類脂，產(chǎn)油率低，部分油脂存在于細胞膜內(nèi)而難以提取，因而目前主要研究利用微藻、霉菌和酵母制取生物燃料。

(1)微藻的培育與利用

微藻是一類分布廣泛種類眾多的低等光合生物，具有生長速度快、產(chǎn)率高、油脂含量高、環(huán)境適應(yīng)力強等優(yōu)點，被認為是生產(chǎn)生物能源的理想原料。目前，學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上百種產(chǎn)油微藻，常見的產(chǎn)油微藻有杜氏鹽藻、小球藻、葡萄藻等。微藻的生長速率和脂質(zhì)含量與光照、溫度、pH值、氮和磷等條件與有密切關(guān)系。Hu和Richmond[7]研究了Isochrysis galbana的細胞濃度與光強的關(guān)系。室外10%光照時，最適細胞濃度為1.9g/L，當(dāng)光照逐漸變?yōu)?0%光照、70%光照和100%光照時，最適細胞濃度也隨增加，分別為2.8g/L、4.0g/L和4.6g/L；生物質(zhì)的最大產(chǎn)率也從0.4g/L/d增大至約1.5g/L/d。趙婷等[8]采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對三角褐指藻、小球藻、微擬球藻和柵藻在不同溫度下的生長及油脂變化規(guī)律進行研究。結(jié)果表明：三角褐指藻、小球藻和柵藻在20℃下的油脂產(chǎn)率最大，分別為2.94mg/L/d、5.79mg/L/d和5.83mg/L/d；而微擬球藻在25℃下油脂產(chǎn)率最大，達6.45mg/L/d。

但在規(guī)?；a(chǎn)時，微藻培養(yǎng)困難，工藝復(fù)雜，提取油脂效率低，生產(chǎn)成本過高，目前尚不能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)生物燃料。

(2)霉菌的培育與利用

產(chǎn)油霉菌不僅油脂含量高，其油脂中還含有豐富的花生四烯酸和γ-亞麻酸，這類功能性多不飽和脂肪酸對在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)有著廣泛的應(yīng)用，產(chǎn)油霉菌因而被廣泛深入的研究。文梅[9]從牧場土壤篩選得到一株油脂含量為30.2%的油脂真菌RBB1-5，研究表明，該霉菌最佳培養(yǎng)基配方為：蛋白胨3.21g/L，葡萄糖103.32g/L，豆粕粉蛋白濃度3.29g/L，Na2HPO42.0g/L，MgSO41.0g/L，KNO33.0g/L；在初始pH6.0、裝液量50mL/250mL、溫度28℃，培養(yǎng)時間5d時，油脂產(chǎn)量為10.38g/L。謝瑩[10]從土壤樣品中篩選到一株產(chǎn)油脂較高的霉菌，通過正交實驗，確定最佳油脂產(chǎn)油條件為葡萄糖100g/L，無機氮源1g/L，pH6.0，溫度28℃。對最佳產(chǎn)油條件進行驗證，油脂含量為30.56%。

(3)酵母的培育與利用

產(chǎn)油酵母相比于其他產(chǎn)油微生物，不存在內(nèi)毒性，基因改造功能強大，環(huán)境適應(yīng)力強，具有工程應(yīng)用的巨大潛力。某些產(chǎn)油酵母培養(yǎng)后體內(nèi)油脂含量可超50%，對產(chǎn)油酵母的研究大有必要。表1是部分產(chǎn)油酵母的油脂含量[11]。

表1 部分產(chǎn)油酵母的油脂含量

從表1中不難看出，圓紅冬孢酵母油脂含量較高，是優(yōu)良的產(chǎn)油酵母，其細胞內(nèi)油脂含量可達70%。大連化物所對該產(chǎn)油酵母研究較為深入，對其基因序列進行了分析檢測，對代謝過程中的問題進行了詳盡的解釋[12]。目前，通過產(chǎn)油酵母制取生物燃料是一個重要的研究方向。孫磊[13]研究發(fā)現(xiàn)，圓紅冬孢酵母突變菌株油脂含量要高于圓紅冬孢酵母，以胰蛋白胨+硫酸銨為氮源，碳氮比為400:1時，圓紅冬孢酵母突變菌株有最大產(chǎn)油量（12.4±0.2）g/L。王琦[14]從7株圓紅冬孢酵母中篩選得到一株油脂含量較高的菌株21167，油脂含量達到63.4%（w/w）。采用單因子實驗對該菌株產(chǎn)油脂培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方為（w/v）：培養(yǎng)基初始pH值為4.0，葡萄糖濃度為8.0%，碳氮比為522，0.15% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.005% CaCl2，0.02% (NH4)2SO4，0.002% ZnSO4·7H2O，0.001% FeCl3·6H2O，0.0002% MnSO4·H2O。

3.微生物菌體破壁技術(shù)

產(chǎn)油微生物培養(yǎng)后，目前通常需要破除細胞壁后再提取油脂。常見的破壁方法有物理法、化學(xué)法和生物法等[15]。物理法通常是用超聲波破碎、滲透壓沖擊破碎、凍融破碎等，其原理是通過物理的撞擊研磨破壞細胞；化學(xué)法是用酸、堿或有機溶劑改變細胞壁的通透性，使其細胞內(nèi)的物質(zhì)有選擇性的釋放到細胞外；生物法是用酶促反應(yīng)破壞細胞壁上的鍵，或使細胞發(fā)生自溶，再通過其他方式提取細胞內(nèi)的物質(zhì)。

畢生雷[16]使用酸熱法對小球藻提取油脂，使用乙酸乙酯為萃取劑，在萃取劑添加量10:1（v/w）、萃取溫度60℃、萃取時間5h條件下，油脂得率可以達到56.59%。林杰[17]對裂殖壺菌使用堿熱法破壁提取DHA油脂，在80℃、復(fù)合堿用量1.0%、破壁時間2.4h，DHA粗油得率為90.65%。杜曉鳳[18]等對微藻使用反復(fù)凍融法破壁，以工業(yè)酒精為提取劑，在65℃水浴中提取2h，提取率達34.6%。羅燦選[19]采用水酶法從小球藻中提取油脂，在藻類質(zhì)量濃度2.5g/L、溫度30℃或50℃、pH3.5或pH4.5、纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶質(zhì)量比為1:1:1或1:2:1時油脂提取率達到86.1%。

4.微生物制備生物燃料技術(shù)

微生物油脂破壁后，常見的提取方法有：溶劑浸提法、超臨界流體萃取法和水酶法等[20]。溶劑浸提法是最常用的提取方法，即根據(jù)相似相溶的原理，用有機溶劑將油脂提取出來。在選取有機溶劑時，應(yīng)按照“安全低毒廉價”的原則選取。正己烷作為常見的萃取試劑，在提取酵母油脂方面，效果較好。索氏法也是溶劑浸提法的一種，只是在提取工藝上采用反復(fù)回流的方式，提取徹底，但耗時較長，樣品處理量較少。超臨界流體萃取法是利用流體進入超臨界區(qū)呈現(xiàn)的聚合狀態(tài)進行萃取，流體的溫度和壓力升高到溶劑的臨界點的萃取過程稱為超臨界萃取。CO2是一種常見的超臨界萃取介質(zhì)。Madalena使用超臨界CO2提取啡渣石油，油脂提取率可達90%[21]。喬寶權(quán)[22]以小球藻為原料，探究了超臨界萃取耦合超臨界原位酯交換反應(yīng)的工藝條件，研究表明，油脂的最高產(chǎn)率達為76%。

產(chǎn)油酵母細胞壁結(jié)構(gòu)堅韌，壁厚約為0.1-0.3μm，細胞老化時，細胞壁厚還會增加。酵母菌屬于單細胞真核微生物，其細胞壁分為三層，外層為甘露聚糖（Mannan），中間為蛋白質(zhì)分子，內(nèi)層為葡聚糖（Glucan）[23]。三層物質(zhì)均為復(fù)雜的分枝狀聚合物，強度較大，一般很難破壁。

常見油脂提取方式均采用細胞破壁-提取油脂的工藝流程實現(xiàn)，在實現(xiàn)的過程中，工藝復(fù)雜，工序繁冗。部分學(xué)者提出通過直接熱解微生物油脂制取生物柴油，使用該方法的實質(zhì)是纖維素與油脂的同步熱解，而對纖維素?zé)峤夂陀椭瑹峤庖延休^多學(xué)者做過研究。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)張立強研究表明，纖維素的熱解區(qū)間為300-400℃，熱解產(chǎn)物主要為生物油，還有少量的氣體產(chǎn)物[24]。劉海超[25]等研究發(fā)現(xiàn)，纖維素在不同的熱解溫度下會生成不同的產(chǎn)物：熱解溫度為200-280℃時，主要產(chǎn)物為脫水纖維素，同時也會有一些氣體和木炭生成；熱解溫度為290-340℃時，主要產(chǎn)物為焦油等揮發(fā)性物質(zhì)；熱解溫度高于400℃時，主要產(chǎn)物為芳環(huán)物質(zhì)，其具有類似石墨的結(jié)構(gòu)。對于油脂熱解，Schwab[26]等研究了菜油和大豆油的熱解反應(yīng)，在熱解溫度為282-338℃條件下，熱解油的產(chǎn)率分別為79%和77%，熱解油的主要成分包括烷烴、烯烴、羧酸以及芳香烴。Thanh[27]研究了不同硅鋁比的HZSM-5對催化熱解大豆油反應(yīng)的影響。結(jié)果表明使用HZSM-5催化劑后，熱解油最高產(chǎn)率為71.3%，其主要成分是C1～C4的烴類，熱值較高。

在微生物油脂直接熱解方面，部分學(xué)者對微藻熱解做過研究。Campanella A等[28]研究了HZSM-5對浮萍催化熱解反應(yīng)的影響，研究結(jié)果表明，添加催化劑后，熱解氣體產(chǎn)率為43%，其主要成分是由甲烷、乙烷、丁烷組成的碳氫化合物。Pan P[29]等使用HZSM-5催化熱解微藻（Nannochloropsis sp.），研究結(jié)果表明，使用HZSM-5催化劑后，熱解油的含氧量僅為19.5%，比未使用催化劑時降低了35.2%。

5.結(jié)論及展望

微生物油脂相對于現(xiàn)有化石燃料和生物燃料具有節(jié)能環(huán)保，低碳排放等優(yōu)點，使用微生物油脂制取生物燃料是一條可持續(xù)發(fā)展的道路。相對于現(xiàn)有的油脂提取技術(shù)，直接熱解產(chǎn)油酵母跨越了細胞破壁的步驟，簡化了油脂提取的工藝流程，是一種生物柴油的新型制取工藝。但對于工藝過程中催化劑種類、熱解溫度、升溫速率、惰性氣體流量等關(guān)鍵參數(shù)尚不明確，在今后的工作中還需要進一步探索。