劉紅燕，李婧姣，路澤軍，劉詠真，溫居一,

1 安徽醫(yī)科大學(xué) 海軍臨床學(xué)院，合肥 230032；2 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 腫瘤內(nèi)科，北京 100048

肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是全球發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤。近年來肝癌的診斷和治療取得了較大進(jìn)展，但晚期肝癌患者預(yù)后仍較差。目前肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，深入分析肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，將有助于發(fā)現(xiàn)新的肝癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在腫瘤形成過程中的表達(dá)機(jī)制頗受關(guān)注，已被公認(rèn)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，與肝癌亦關(guān)系密切[1-2]。

在人類基因組中，參與編碼蛋白質(zhì)的基因僅占2%，超過98%基因組不編碼蛋白質(zhì)，其基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[3]。根據(jù)其長度，可將ncRNA分為miRNA、snoRNA、piRNA和lncRNA等[4]。ncRNA中大多數(shù)為lncRNA，lncRNA的基因長度往往>200 bp，其開放閱讀框一般短于50～100 bp。根據(jù)lncRNA在基因組中與編碼蛋白質(zhì)基因的相對(duì)位置，可將其分成5類，即反義lncRNA、正義lncRNA、雙向lncRNA、基因內(nèi)lncRNA和基因間lncRNA[5]。隨著二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，成千上萬的lncRNA在脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物體內(nèi)被快速鑒別出來。但是，二代測(cè)序技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在很多缺陷，如文庫制備過程中PCR擴(kuò)增很大程度會(huì)使后續(xù)結(jié)果出現(xiàn)誤差，而且盡管已經(jīng)開發(fā)出各種算法來提高測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量，但其對(duì)于組裝一個(gè)橫跨整個(gè)基因組的長片段仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。lncRNA通常長度較長且存在多種剪接形式，單純的RNA-Seq并不能分辨各種異構(gòu)體，因此第三代測(cè)序技術(shù)的誕生就顯得尤為重要[6]。

PacBio作為最新一代的測(cè)序技術(shù)，是由美國Pacific Bioscience開發(fā)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(molecule real time sequencing，SMRT)技術(shù)，測(cè)序過程無需PCR擴(kuò)增。其在讀取長度方面遠(yuǎn)超于二代測(cè)序技術(shù)，并且無GC偏好性，能夠大大提升基因組組裝的質(zhì)量[7]。PacBio在研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面最大的優(yōu)勢(shì)在于它能夠獲得全長或接近全長的轉(zhuǎn)錄本，這對(duì)可變剪切的鑒定、lncRNA的分析[8-9]以及新基因的發(fā)現(xiàn)等研究有著重要意義；且能在原有研究基礎(chǔ)上進(jìn)行補(bǔ)充甚至發(fā)現(xiàn)新的機(jī)制。

本研究主要利用PacBio三代測(cè)序技術(shù)在肝癌組織中鑒定新的lncRNA，并在肝癌細(xì)胞中進(jìn)行功能機(jī)制的初步探索。

1 材料與方法

1.1 研究材料 收集2018年2月—2019年6月解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心12例肝癌患者的腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織。人肝癌細(xì)胞系(Hep G2、SNU-398和Hep 3B)購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；人永生化正常肝細(xì)胞(THLE-2)購自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI-1640及胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Smarter PCR cDNA合成試劑盒購自美國Clontech公司；SYBR Green染料購自日本Takara公司；所有引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；CNOT4、EIF4G2、HNRNPA1、MBNL1、RBM24、RBM6、SRSF10抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；RBM38、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自英國Abcam公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司；Transwell小室購自康寧公司；RNA熒光原位雜交(RNA fluorescence in situ hybridization，RNA FISH)和EdU檢測(cè)試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；靶向lncRNA MIR205HG的siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)與合成；pCMV-RBM38購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；pEXP-LNC01309野生型和突變型表達(dá)載體由廣州銳博生物科技有限公司構(gòu)建完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照培養(yǎng)基和血清配比為9∶1配置完全培養(yǎng)基；所有細(xì)胞均采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱為細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 3000試劑。在6孔板中，接種細(xì)胞濃度為1×106/孔，培養(yǎng)基體積2 mL，其中siRNA用量為20 nmol/L/孔，質(zhì)粒用量為8 μg/孔，共孵育24 h后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 RNA提取 采用Trizol提取組織或細(xì)胞中的RNA。按100 mg組織加1 mL Trizol研磨，制備組織懸液；5×106細(xì)胞加入1 mL Trizol吹打，收獲細(xì)胞懸液；且冰上裂解5～10 min后，按200 μL氯仿﹕1 mL Trizol的比例加入氯仿，混勻液體，靜置15 min。然后4 ℃ 12 000 r/min離心分離RNA，吸取上清液至新的EP管中并棄去沉淀。加入等體積異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入75%酒精充分洗滌沉淀，離心去除上清液。最后將RNA樣品沉淀置于超凈臺(tái)干燥5 min，加入DEPC水溶解，Nanodrop測(cè)量總RNA濃度，并置于-80 ℃保存。

1.4 PacBio三代測(cè)序 利用Trizol提取組織RNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書，共使用4 μg混合RNA與Pacbio Sequel系統(tǒng)(Pacific Biosciences，CA，USA)進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄序列測(cè)序。使用Clontech Smarter PCR cDNA合成試劑盒和Pacific Biosciences的luePippin Size Selection系統(tǒng)(PN100-092-800-03)，根據(jù)異構(gòu)體測(cè)序(Iso-Seq)協(xié)議制備Iso-Seq文庫。后續(xù)測(cè)序與分析由北京基石生命科技有限公司完成。

1.5 熒光定量PCR 按照試劑盒說明書使用寡(dT)引物在總體積為20 μL的條件下進(jìn)行cDNA合成；采用染料法，使用最終體積為25 μL的500 ng cDNA模板進(jìn)行熒光定量PCR。重復(fù)3次試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下(5′-3′)，lncRNA MIR205HG：正向引物AGCAGCAGCAGCAAGAGTAA，反向引物GAAAGATTAAGGTTCCCATC；LNC01309：正向引物AGCAGCAGCAGCAAGAGTAACT，反向引物GAAAGATTAAGGTTCCCATC；RBM38：正向引物GCTACGGCTTCGTGACCAT，反向引物GTAAGTCCGCTGGATCAAGGT；GAPDH：正向引物AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反向引物AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

1.6 Western Blot 冰上裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，向50 μg蛋白樣品中加入等體積的2×Laemmli上樣緩沖液，總上樣體積為20 μL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。接著進(jìn)行恒流(200 mA)轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，4 ℃孵一抗過夜。次日進(jìn)行二抗常溫孵育，二抗孵育完成后加入化學(xué)發(fā)光液與蛋白條帶反應(yīng)，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.7 細(xì)胞增殖檢測(cè) 使用CCK-8和EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖。CCK-8檢測(cè)：按照1×104/孔細(xì)胞數(shù)接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長覆蓋率達(dá)到50%左右，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞并持續(xù)培養(yǎng)4 d。分別于不同時(shí)間點(diǎn)(0、24、48、72、96 h)棄去培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基配置的10% CCK-8反應(yīng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長在450 nm處的吸光度值。EdU檢測(cè)：細(xì)胞接種于96孔板中，經(jīng)轉(zhuǎn)染處理24 h。然后將50 μmol/L EdU加入培養(yǎng)孔，37 ℃孵育2 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞。按照標(biāo)準(zhǔn)程序，anti-EdU工作液和DAPI染色孵育細(xì)胞。于熒光顯微鏡(奧林巴斯IX71)下觀察，隨機(jī)選取不同視野記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn) 將各組Hep G2細(xì)胞按1×106/孔接種于6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第2天用10 μL槍頭劃兩條平行線，形成劃痕。使用PBS輕輕漂洗2～3遍，加人無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、12 h觀察，拍照。用Image J分析遷移面積并計(jì)算遷移率。

1.9 Transwell遷移試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞按照5×104細(xì)胞數(shù)分別接種于Transwell的上室，下室中加入800 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，采用PBS清洗3次，甲醇固定15 min，用DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個(gè)以上視野拍照計(jì)數(shù)。

1.10 RNA FISH 使用預(yù)冷的Triton X-100(0.1%)使細(xì)胞膜通透，并用多聚甲醛(4%)處理載玻片。然后用LNC01309探針雜交過夜。SCC緩沖液清洗細(xì)胞。采用DAPI染細(xì)胞核后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.11 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性測(cè)定 用終濃度100 μg/mL的放線菌酮處理細(xì)胞，并在指定時(shí)間點(diǎn)(0、2、4 h)收取細(xì)胞。從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。β-肌動(dòng)蛋白用作參照。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA LNC01309在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá) 在肝癌和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中利用PacBio測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)1條高豐度且未見報(bào)道的lncRNA(圖1a)，長度為309 nt，暫命名為LNC01309。利用熒光定量PCR檢測(cè)分析，結(jié)果顯示肝癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中LNC01309水平分別為4.225±2.285與1.541±0.530，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.618，P=0.004)(圖1b)。將永生化正常肝細(xì)胞(THLE-2)和多種肝癌細(xì)胞(Hep G2、SNU-398和Hep 3B)中的LNC01309表達(dá)情況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，LNC01309在肝癌細(xì)胞中的相對(duì)含量分別為1.860±0.126、2.313±0.383和3.917±0.393，均明顯高于THLE-2細(xì)胞(1.011±0.074)(t值分別為4.231、6.489、14.480，P值分別為0.004、<0.001、<0.001)(圖1c)。

注：a，PacBio測(cè)序分析獲得的LNC01309序列；b，利用熒光定量PCR分析LNC01309在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異；c，利用熒光定量PCR分析LNC01309在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)差異。

2.2 LNC01309與lncRNA MIR205HG的關(guān)系分析 利用NCBI BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析，LNC01309定位于1號(hào)染色體(209432225-209432545)，與lncRNA MIR205HG存在較高的序列相似性(表1)。lncRNA MIR205HG亦定位于1號(hào)染色體(209428820-209432549)，其目前存在5種剪接體，通過序列比對(duì)分析，筆者設(shè)計(jì)了特異的PCR引物用于區(qū)分檢測(cè)lncRNA MIR205HG和LNC01309(圖2a)。結(jié)果顯示，lncRNA MIR205HG無論是在肝癌組織還是在肝癌細(xì)胞中均不存在異常表達(dá)現(xiàn)象(圖2b、c)。隨后，在Hep 3B肝癌細(xì)胞中利用siRNA敲降lncRNA MIR205HG，分為NC siRNA對(duì)照組(NC si)和MIR205HG siRNA處理組(MIR205HG si)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著lncRNA MIR205HG的下調(diào)(1.001±0.082 vs 0.281±0.062，t=15.690，P<0.001)(圖2d)，LNC01309并未明顯下降(1.008±0.046 vs 1.075±0.085，t=1.534，P=0.164)(圖2e)。值得注意的是，LNC01309本身序列中并不含有miR-205序列，因此在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)LNC01309，分為質(zhì)粒對(duì)照組(pEXP-control)和過表達(dá)組(pEXP-LNC01309)(1.006±0.099 vs 27.350±5.744，t=9.172，P<0.001)并沒有導(dǎo)致miR-205相對(duì)含量的變化(0.971±0.083 vs 0.962±0.100，t=0.142，P=0.892)(圖2f、g)。

表1 利用NCBI BLAST比較LNC01309與lncRNA MIR205HG序列相似性

2.3 LNC01309促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與遷移 筆者嘗試在含有較低豐度LNC01309的Hep G2細(xì)胞中過表達(dá)LNC01309(1.006±0.099 vs 27.350±5.744，t=9.172，P<0.001)。RNA FISH試驗(yàn)結(jié)果與在線工具Locate-R(http://locate-r.azurewebsites.net/)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，LNC01309主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖3、4)。隨著LNC01309水平的升高，肝癌細(xì)胞的增殖能力(第96小時(shí)OD450值：1.885±0.107 vs 2.527±0.234，t=4.330，P=0.012)顯著上調(diào)(圖5、6)。同時(shí)，劃痕愈合試驗(yàn)(11.65%±2.40% vs 35.66%±4.90%，t=9.837，P<0.001)(圖7)和Transwell試驗(yàn)結(jié)果(100.00%±3.11% vs 161.00%±35.93%，t=4.399，P=0.005)(圖8)均顯示肝癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。Western Blot結(jié)果顯示，過表達(dá)LNC01309會(huì)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標(biāo)志蛋白N-cadherin(0.466±0.067 vs 1.253±0.046，t=5.322，P=0.009)和Vimentin(0.372±0.126 vs 2.638±0.413，t=7.292，P=0.018)的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)(0.909±0.032 vs 0.151±0.014，t=50.450，P<0.001)(圖9)。

注：a，LNC01309與lncRNA MIR205HG序列相似性，并根據(jù)序列差異性設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物；b，利用熒光定量PCR分析lncRNA MIR205HG在肝癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異；c，利用熒光定量PCR分析lncRNA MIR205HG在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)差異；d、e，Hep 3B細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA(20 nmol/L)處理24 h后，利用熒光定量PCR分別檢測(cè)lncRNA MIR205HG和LNC01309的相對(duì)表達(dá)含量；f、g，Hep G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒24 h后，利用熒光定量PCR分別檢測(cè)LNC01309和miR-205的相對(duì)表達(dá)含量。

圖3 在線工具Locate-R預(yù)測(cè)LNC01309的細(xì)胞定位

注：Hep G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LNC01309表達(dá)質(zhì)粒以及對(duì)照質(zhì)粒(24孔板中使用量為1 μg/孔)處理，于不同時(shí)間點(diǎn)利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。

圖6 EdU染色試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染LNC01309表達(dá)質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞增殖

圖7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染LNC01309表達(dá)質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞的遷移能力

圖8 Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染LNC01309表達(dá)質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞的遷移能力

圖9 Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白的相對(duì)含量

2.4 LNC01309與RNA結(jié)合蛋白的相互作用 利用在線工具RBPmap(http://rbpmap.technion.ac.il/index.html)和catRAPID(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)分析LNC01309的潛在結(jié)合蛋白，獲得了CNOT4、EIF4G2、HNRNPA1、MBNL1、RBM24、RBM38、RBM6和SRSF10共8個(gè)排名靠前的候選蛋白(表2)。隨后，在Hep G2細(xì)胞中過表達(dá)LNC01309，利用候選蛋白的特異抗體進(jìn)行RNA免疫共沉淀試驗(yàn)，富集結(jié)果分別為0.087±0.044、0.120±0.107、0.192±0.105、0.164±0.093、0.153±0.108、0.502±0.213、0.124±0.085和0.168±0.068；與IgG對(duì)照組比較，僅RBM38抗體組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.502±0.213 vs 0.060±0.029，t=3.846，P=0.031)(圖10a)。將RBM38潛在結(jié)合位點(diǎn)(gugugcg)

表2 利用RBPmap和catRAPID在線預(yù)測(cè)能夠與LNC01309結(jié)合的潛在靶標(biāo)蛋白

缺失突變后構(gòu)建突變型LNC01309。RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與IgG對(duì)照組比較，RBM38抗體組沉淀富集的野生型LNC01309相對(duì)含量顯著升高(0.434±0.122 vs 0.034±0.017，t=5.123，P=0.036)，而突變型LNC01309在兩組中的沉淀富集豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.077±0.051 vs 0.031±0.006，P=0.201)(圖10b)。

注：a，利用潛在RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體進(jìn)行RNA-IP試驗(yàn)，熒光定量PCR檢測(cè)LNC01309的富集豐度；b，熒光定量PCR比較RBM38的抗體對(duì)野生型和突變型LNC01309的富集豐度差異。

2.5 LNC01309影響RBM38蛋白穩(wěn)定性 在相對(duì)低表達(dá)LNC01309的Hep G2細(xì)胞中過表達(dá)LNC01309時(shí)，并不會(huì)影響RBM38 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(1.022±0.074 vs 0.953±0.076，P=0.185)，但會(huì)降低RBM38蛋白的相對(duì)含量(0.960±0.057 vs 0.228±0.044，t=5.526，P=0.008)(圖11)。利用放線菌酮處理Hep G2細(xì)胞，LNC01309過表達(dá)組細(xì)胞中RBM38蛋白的穩(wěn)定性顯著低于對(duì)照質(zhì)粒組(第4小時(shí)相對(duì)蛋白含量：0.610±0.075 vs 0.179±0.054，t=8.038，P=0.001)(圖12、13)。此外，過表達(dá)的RBM38能夠有效抑制LNC01309的促細(xì)胞增殖能力(第96小時(shí)OD450值：2.500±0.227 vs 1.913±0.282，t=2.812，P=0.048)(圖14)。細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)結(jié)果(30.69%±5.80% vs 16.37%±1.66%，t=6.218，P<0.001)(圖15)和Transwell試驗(yàn)結(jié)果(168.00%±9.43% vs 117.20%±18.03%，t=6.622，P<0.001)(圖16)均顯示過表達(dá)的RBM38能夠有效抑制LNC01309誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞遷移能力的上調(diào)。

圖11 Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染LNC01309表達(dá)質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞24 h后RBM38蛋白的相對(duì)表達(dá)含量

圖12 Western Blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)放線菌酮處理轉(zhuǎn)染LNC01309表達(dá)質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞中的RBM38蛋白相對(duì)含量

圖13 不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)經(jīng)放線菌酮處理轉(zhuǎn)染LNC01309表達(dá)質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞中RBM38蛋白相對(duì)含量

注：Hep G2細(xì)胞中單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEXP-LNC01309或者共轉(zhuǎn)染pCMV-RBM38質(zhì)粒24 h后，于不同時(shí)間點(diǎn)利用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活性。

圖15 細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的遷移能力

圖16 Transwell檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞的遷移能力

3 討論

大量的研究[10-12]工作已經(jīng)證實(shí)lncRNA與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。例如，lncRNA ATB競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miR-200，進(jìn)而激活ZEB1和ZEB2的表達(dá)；ZEB1和ZEB2與IL-11 mRNA的相互作用增強(qiáng)了Stat3信號(hào)，促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移，加速器官受累[13]。lncRNA HULC在肝癌中異常高表達(dá)[14]，能夠介導(dǎo)腫瘤抑制因子P18的下調(diào)，可促進(jìn)肝癌的細(xì)胞增殖[15]。lncRNA HOTAIR降低

了CREB、P300、RNApoⅢ在SETD2啟動(dòng)子區(qū)域的重新分配，從而抑制了SETD2的表達(dá)和磷酸化，借此促進(jìn)人類肝癌干細(xì)胞的惡性生長[16-17]。目前發(fā)現(xiàn)lncRNA主要有以下幾個(gè)方面的調(diào)控功能[18-19]。(1)表觀遺傳學(xué)：通過干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合、誘導(dǎo)蛋白質(zhì)修飾和染色質(zhì)發(fā)生重構(gòu)等方式影響編碼基因表達(dá)；(2)轉(zhuǎn)錄調(diào)控：與靶蛋白結(jié)合后影響基因轉(zhuǎn)錄；(3)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：能調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯進(jìn)程，作用蛋白結(jié)合伴侶或調(diào)節(jié)蛋白的亞細(xì)胞定位影響蛋白活性等，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展[20]；(4)編碼微肽：lncRNA重新獲得編碼能力，產(chǎn)生具有功能的微肽[21]。筆者通過PacBio測(cè)序分析LNC01309顯示，在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。后續(xù)的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LNC01309能夠與RBM38蛋白發(fā)生相互作用，并借此下調(diào)RBM38蛋白穩(wěn)定性。

RBM38是一種RNA結(jié)合蛋白，在正常細(xì)胞中通過調(diào)控RNA參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期循環(huán)、肌源性分化等多種生物學(xué)過程。目前已知RBM38可與p53、mdm2、p63、p73、p21、c-Myc和MIC-1等多個(gè)目的基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)mRNA的穩(wěn)定性，從而在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22-27]?，F(xiàn)有研究[28]顯示，RBM38可能通過穩(wěn)定p53-mdm2環(huán)抑制肝癌的發(fā)生。p53-mdm2通路在肝癌中經(jīng)常發(fā)生改變，mdm2和p53基因突變可增加mdm2的穩(wěn)定性，加速p53降解，破壞p53-mdm2平衡，從而誘導(dǎo)癌變，最終促進(jìn)肝癌發(fā)生。Ye等[28]報(bào)道RBM38作為穩(wěn)定p53-mdm2環(huán)的重要分子，在肝癌組織中RBM38失活，而mdm2表達(dá)增加，野生型p53表達(dá)隨之降低，最終破壞p53-mdm2環(huán)的平衡；相反，若增加RBM38表達(dá)則可抑制肝癌細(xì)胞mdm2的表達(dá)，恢復(fù)野生型p53的表達(dá)，從而在體外抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲；裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示RBM38對(duì)肝癌的體內(nèi)致瘤性具有一定抑制作用。以上體內(nèi)外研究結(jié)果表明，上調(diào)RBM38可能通過抑制mdm2從而拯救野生型p53，進(jìn)而改變肝癌的生物學(xué)功能和進(jìn)展。本研究結(jié)果表明RBM38能夠與野生型LNC01309發(fā)生結(jié)合作用，而不能夠結(jié)合突變型LNC01309。LNC01309通過與RBM38的相互作用降低RBM38的蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性表型特征。

LNC01309與lncRNA MIR205HG具有較高的序列相似性。然而敲降已知的lncRNA MIR205HG不同剪接體，并不會(huì)改變LNC01309的相對(duì)含量。這些結(jié)果提示，LNC01309并不是已知lncRNA MIR205HG的再加工形式或者降解片段，其可能是MIR205HG基因初始轉(zhuǎn)錄本的另一種剪接體形式。已知的lncRNA MIR205HG在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中并不存在異常表達(dá)現(xiàn)象，這也是與LNC01309最大的區(qū)別。

LNC01309在肝癌細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞質(zhì)。由于lncRNA通常會(huì)作為內(nèi)源性RNA海綿與miRNA作用并影響miRNA的表達(dá)與功能，而lncRNA定位于細(xì)胞質(zhì)是這一功能發(fā)揮的前提條件，因此LNC01309理論上存在參與調(diào)控miRNA表達(dá)與功能的潛質(zhì)，這也是后續(xù)應(yīng)開展的研究方向。

綜上，本研究團(tuán)隊(duì)依賴于肝癌組織的PacBio測(cè)序分析獲得一條全新lncRNA LNC01309，在肝癌細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)功能探索，初步證明LNC01309通過與RBM38相互作用降低了RBM38的蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與遷移。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉紅燕參與課題設(shè)計(jì)，完成試驗(yàn)，文章寫作；李婧姣、路澤軍、劉詠真參與試驗(yàn)、收集和分析數(shù)據(jù)及修改文章；溫居一負(fù)責(zé)研究方案總體規(guī)劃設(shè)計(jì)，指導(dǎo)撰寫文章及論文修改。