李 紅， 李 波， 李晨陽(yáng)， 楊 曌

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾 161005； 2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

黃酮類化合物分離純化的方法很多，其中大孔樹(shù)脂是近十多年飛速發(fā)展的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，能夠吸附和分離大量有機(jī)物，具有污染低、穩(wěn)定性高、選擇性強(qiáng)、易操作等優(yōu)點(diǎn)[7]。大孔樹(shù)脂廣泛應(yīng)用于中草藥活性成分的分離純化研究方面，尤其在黃酮類成分中如香椿(Toonasinensis)黃酮類成分[8]、蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)黃酮類化合物[9]和趕黃草(PenthorumchinensePursh)黃酮成分[10]等分離純化的研究。關(guān)于紫花苜蓿黃酮類化合物的純化、抗氧化活性已有相關(guān)研究[11-12]，但對(duì)紫花苜?？傸S酮的提取、純化及其抗氧化活性[13]研究鮮見(jiàn)報(bào)道，對(duì)苜蓿總黃酮的純化和純化前后的抗氧化活性更是有待完善。

為了充分利用紫花苜蓿資源，本研究采用超聲波輔助提取的方式提取了苜?？傸S酮，大大縮短了苜?？傸S酮的提取時(shí)間，通過(guò)確定的超聲波輔助提取苜?？傸S酮的最佳條件[14]，并且利用大孔樹(shù)脂對(duì)所獲得的總黃酮進(jìn)行了純化，分析純化前后的苜蓿總黃酮的抗氧化能力，為紫花苜蓿的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取試驗(yàn)基地種植2年的‘龍牧801’紫花苜蓿，于7月份盛花期收割其地上部分莖葉，置于避光通風(fēng)處自然陰干，篩去草棒、枯草等雜質(zhì)，后用高速多功能粉碎機(jī)將干草粉碎成草粉，置于密封盒內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 苜?？傸S酮粗提取物的制備

前期試驗(yàn)采用超聲波輔助提取苜?？傸S酮，得到最優(yōu)條件為物料比1∶40(g·mL-1)、超聲功率180 W、超聲時(shí)間 40 min、乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，提取液真空抽濾后用等體積石油醚多次萃取去除葉綠素等雜質(zhì)，收集萃取后的濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸發(fā)，直至濾液無(wú)乙醇味。收集減壓蒸發(fā)完畢后的濾液，用體積分?jǐn)?shù)為 60% 的乙醇重新定容至 50 mL備用，所得液體即為超聲波輔助提取法苜?？傸S酮粗提液。

1.3 總黃酮含量測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.3.1苜?？傸S酮含量的測(cè)定 采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法[13]。移取 5.0 mL樣品液于 25.0 mL具塞刻度試管，加 5 mL 60% 的乙醇和 5% 亞硝酸鈉溶液 1.0 mL靜置 6 min，再加入 10% 硝酸鋁溶液 1.0 mL再靜止 6 min，再向其中加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液 10.0 mL靜置 15 min，后用蒸餾水定容至25 mL，同時(shí)用 60% 乙醇作空白對(duì)照，于 510 nm測(cè)定吸光值。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考荊常亮[13]方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。用體積分?jǐn)?shù) 60% 乙醇溶液配制成 0.2 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 和 6.0 mL) 于10.0 mL具塞試管中，用蒸餾水定容至 5.0 mL。采用1.3.1方法測(cè)定吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y =13.893x-0.005 9(R2=0.997 3)，式中x表示蘆丁質(zhì)量濃度，y表示吸光值，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在 0.00～0.48 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

參考許中暢等[15]方法。用 95%乙醇溶液震蕩浸泡 24 h(搖床設(shè)置參數(shù)為25℃，120 r·min-1，使大孔樹(shù)脂和乙醇充分接觸并去除氣泡)，采用濕法裝柱的方式將泡好的大孔樹(shù)脂裝入玻璃層析柱(Φ30 mm×300 mm)中，用 95% 乙醇淋洗樹(shù)脂柱，直至流出液澄清透明無(wú)渾濁為止。然后分別用 4 BV的4%NaOH溶液堿洗(后用去離子水淋洗過(guò)柱，當(dāng)流出液pH值≤9.0 時(shí)停止水洗)和 4% HCl溶液酸洗(后用去離子水淋洗過(guò)柱，當(dāng)流出液pH值≥6.0 時(shí)停止水洗)淋洗大孔樹(shù)脂，后用 95% 乙醇浸泡層析柱內(nèi)樹(shù)脂 2 h，相同的乙醇過(guò)柱清洗(堿液、酸液和乙醇總用量為3～4 BV，以1 BV·h-1流速)，最后用去離子水洗至中性，在樹(shù)脂床上層保留一定液面防止干柱，備用。

1.5 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)

1.5.1樹(shù)脂的篩選 分別稱取預(yù)處理好的樹(shù)脂1.0 g，加入 0.1 mg·mL-1粗提液 50 mL，25℃，120 r·min-1下震蕩吸附 24 h后過(guò)濾，測(cè)定濾液總黃酮質(zhì)量濃度，即為吸附平衡液總黃酮質(zhì)量濃度；收集上述飽和吸附的樹(shù)脂，用蒸餾水沖洗樹(shù)脂表面殘留的總黃酮，置于100 mL三角瓶中加入50 mL體積分?jǐn)?shù) 60% 乙醇，在 25℃，120 r·min-1下解吸附 24 h后過(guò)濾，測(cè)量濾液中總黃酮質(zhì)量濃度。按公式計(jì)算吸附量、吸附率、解吸量和解吸率。

式中，Q1為吸附量(mg·g-1)，E1為吸附率(%)，Q2為解吸量(mg·g-1)，E2為解吸率，C0為最初樣液總黃酮濃度(mg·mL-1)，Ce為吸附后平衡液總黃酮濃度(mg·mL-1)，V0為待純化母液體積(mL)，Cd為解吸附洗脫液中總黃酮濃度(mg·mL-1)，V2為解吸附洗脫液體積(mL)，M為濕重樹(shù)脂的質(zhì)量(g)。

1.5.2靜態(tài)吸附曲線測(cè)定 選擇吸附和解吸附效果最好的大孔樹(shù)脂，稱取3.0 g置于100 mL三角瓶中，加入 0.1 mg·mL-1粗提液 50 mL，在25℃，120 r·min-1下振蕩吸附3 h，每隔0.5 h吸取5 mL，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算并繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.6 D101大孔樹(shù)脂純化苜?？傸S酮上樣條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

1.6.1吸附液pH值 稱取5份2.0 g濕重大孔樹(shù)脂置于錐形瓶中，分別加入濃度為0.1 mg·mL-1總黃酮20 mL，設(shè)置pH值為3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，在25℃，120 r·min-1下震蕩吸附12 h后測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算吸附率。

1.6.2上樣液質(zhì)量濃度 將1.0 mg·mL-1總黃酮母液用蒸餾水配制成總黃酮質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg·mL-1的上樣液，根據(jù)最優(yōu)pH參數(shù)調(diào)節(jié)上樣液pH值，上樣體積為2 BV，將上樣液裝入樹(shù)脂柱中后以1 BV·h-1的流速進(jìn)行吸附，收集流出液，根據(jù)上樣液原始濃度和流出液濃度計(jì)算吸附率及解吸附率。

1.6.3上樣液體積 將1.0 mg·mL-1總黃酮母液用蒸餾水配制成0.8 mg·mL-1，并調(diào)成最優(yōu)pH值即為待上樣液，以1 BV·h-1流速進(jìn)行吸附，分別收集并測(cè)定吸附液體積達(dá)到1 BV，2 BV，3 BV和4 BV時(shí)總黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算吸附率。

1.6.4驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述試驗(yàn)選擇最適宜苜?？傸S酮的大孔樹(shù)脂，并按照上述篩選的吸附液pH值、上樣液質(zhì)量濃度和上樣液體積最適條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù) 3次平均值，根據(jù)吸附流出液及洗脫液OD值計(jì)算吸附率及解吸率。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至膏狀，置于坩堝中用電爐烤干至恒重，按公式計(jì)算大孔樹(shù)脂吸附純化后苜?？傸S酮純度。

式中，C為上樣液中總黃酮濃度(mg·mL-1)，V為上樣液體積(mL)，M1為烘干后干粉質(zhì)量(mg)。

1.7 粗制和純化的苜?？傸S酮抗氧化活性測(cè)定

1.8 數(shù)據(jù)的處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分(Anova)比較不同處理間的差異顯著性，P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種大孔樹(shù)脂吸附及解吸附效果對(duì)比

大孔樹(shù)脂的孔徑和比表面積影響其對(duì)活性成分的“吸附-解吸”性能，二者呈負(fù)相關(guān)。4種大孔樹(shù)脂對(duì)苜?？傸S酮的吸附和解吸附效果見(jiàn)表1，在相同條件下，這4種大孔樹(shù)脂對(duì)苜蓿總黃酮都有一定的“吸附-解吸”能力，其靜態(tài)吸附率排序?yàn)锳B-8>D101>HPD100>HPD600，D101和AB-8與HPD100，HDP600之間存在顯著差異(P<0.05)；其靜態(tài)解吸率排序?yàn)镈101>AB-8>HPD100>HPD600，D101，AB-8與HPD100和HDP600之間存在顯著差異(P<0.05)，這可能是因?yàn)锳B-8和D101大孔樹(shù)脂結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)決定的，利于苜?？傸S酮的吸附和洗脫，綜合考慮吸附率和解吸率，D101大孔樹(shù)脂是純化苜蓿總黃酮較為理想的樹(shù)脂。

表1 4種大孔樹(shù)脂吸附及解吸附效果對(duì)比Table 1 Comparison of adsorption and desorption effects of four macroporous resins

2.2 D101大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附曲線

D101大孔樹(shù)脂對(duì)苜?？傸S酮的靜態(tài)吸附量和提取液總黃酮含量變化見(jiàn)圖1。在吸附前2 h，苜?？傸S酮的吸附量隨著時(shí)間增加而上升，2 h后上升速率降低，吸附量趨于平緩，吸附2 h平均吸附量為0.72 mg·g-1，比第3小時(shí)降低0.03 mg·g-1，再增加吸附時(shí)間其吸附量變化不顯著，說(shuō)明D101大孔樹(shù)脂對(duì)苜?？傸S酮吸附性能較好，吸附2 h左右基本達(dá)到吸附飽和值。D101大孔樹(shù)脂對(duì)苜蓿總黃酮的吸附為快速平衡型，初始總黃酮質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1，2 h后基本達(dá)到平衡，對(duì)苜蓿總黃酮具有良好的吸附動(dòng)力學(xué)特性，該樹(shù)脂對(duì)苜蓿總黃酮有良好的吸附特性，適于分離純化苜?？傸S酮。

圖1 D101大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curve of D101 macroporous resin

2.3 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)條件的確定

2.3.1上樣液pH值的確定 由圖2A可知，D101大孔樹(shù)脂對(duì)苜蓿總黃酮的吸附率隨上樣液pH值增加而減小，這是因?yàn)檐俎？傸S酮含有多羥基酚類而表現(xiàn)為弱酸性，當(dāng)pH值為3.0時(shí)吸附率最高為69.63%，而堿性環(huán)境時(shí)俘獲的質(zhì)子會(huì)使總黃酮自由基上的氫解離為酸根離子，減弱與樹(shù)脂的結(jié)合力，導(dǎo)致對(duì)總黃酮吸附率下降，在pH值為7.0時(shí)吸附率最低為32.30%，不同pH值的上樣液對(duì)苜蓿總黃酮的吸附率產(chǎn)生顯著差異(P< 0.05)。因此本試驗(yàn)中當(dāng)pH值為3.0時(shí)D101大孔樹(shù)脂對(duì)苜?？傸S酮吸附效果最佳。

2.3.2上樣液質(zhì)量濃度的確定 由圖2B可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，大孔樹(shù)脂對(duì)苜?？傸S酮的吸附率呈先升后降的趨勢(shì)，在總黃酮質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1上柱時(shí)，吸附率最大為92.27%，超過(guò)此質(zhì)量濃度后吸附效果下降,因?yàn)樯蠘右嘿|(zhì)量濃度偏高,會(huì)發(fā)生提早泄漏現(xiàn)象,導(dǎo)致處理量下降；總黃酮質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1上柱時(shí)，吸附率最低，上樣液質(zhì)量濃度偏低，吸附不充分,降低了吸附率，上樣液質(zhì)量濃度為0.4和0.6 mg·mL-1與其它濃度間比較苜?？傸S酮的吸附率差異顯著(P<0.05)。

2.3.3上樣液體積的確定 由圖2C可知，在上樣液體積為1 BV，2 BV，3 BV和4 BV時(shí)，隨著上樣液體積增加吸附率呈下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)上樣體積為2 BV時(shí)吸附率最大為93.62%，超過(guò)2 BV后吸附率劇烈下降，可能是上樣體積在2～3 BV之間時(shí)發(fā)生了泄漏，影響吸附效果，當(dāng)上樣體積為2 BV時(shí)D101大孔樹(shù)脂吸附效果比較好，上樣液體積為1和2 BV時(shí)苜?？傸S酮的吸附率顯著高于上樣體積為3和4 BV(P< 0.05)。

圖2 上樣液條件對(duì)苜?？傸S酮吸附率的影響Fig.2 Effect of sample loading conditions on adsorption rate of total flavonoids from alfalfa

2.4 苜蓿總黃酮純化工藝驗(yàn)證

以D101大孔樹(shù)脂對(duì)苜?？傸S酮進(jìn)行純化，在確定的上樣液pH值為3，上樣液質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1，上樣體積為2 BV的純化參數(shù)條件下，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)純化條件進(jìn)行驗(yàn)證(表2)。流出液吸附率平均值為92.72%，洗脫液解析率平均值為75.99%，較控制單一因素的純化效果為好。

表2 純化工藝驗(yàn)證Table 2 Validation test data

洗脫液干燥至粉末狀后稱重，3組重復(fù)試驗(yàn)的苜?？傸S酮純度平均值為31.46%，可有效去除了其中雜質(zhì)，因此D101大孔樹(shù)脂對(duì)苜蓿總黃酮的純化工藝可行，但該結(jié)果所得純度比較低，可進(jìn)一步采用聚氨酰樹(shù)脂純化以提高苜蓿總黃酮粗提液的純度。

2.5 苜蓿總黃酮純化前后抗氧化能力比較

2.5.1清除DPPH·能力 由圖3A可知，苜蓿總黃酮粗提物與純化物都具有較強(qiáng)的清除DPPH·能力，隨苜?？傸S酮質(zhì)量濃度的增加而增大。當(dāng)粗提物、純化物和VC的濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率分別為81.53%，88.54%和93.23%，粗提物、純化物和VC的濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，較濃度為0.2 mg·mL-1對(duì)DPPH·的清除率分別增加了12.46%，5.60%和2.94%。相同質(zhì)量濃度下純化物均促進(jìn)了對(duì)DPPH·的清除能力，但對(duì)DPPH·的清除率均低于VC，純化物總黃酮質(zhì)量濃度1.0 mg·mL-1較相同濃度下的VC對(duì)DPPH·的清除率減少了2.58%,差異不顯著。

2.5.2清除ABTS+·能力 由圖3B可知，苜?？傸S酮粗提物與純化物都具有較強(qiáng)的清除ABTS+·能力，隨苜?？傸S酮質(zhì)量濃度的增加而增大。當(dāng)粗提物、純化物和VC的濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率分別為74.63%，81.74%和95.29%，粗提物、純化物和VC的濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，較濃度為0.2 mg·mL-1對(duì)ABTS+·的清除率分別增加了14.08%，13.11%和0.63%。相同濃度下純化物均促進(jìn)了對(duì)ABTS+·的清除能力，但對(duì)ABTS+·的清除率均低于VC，純化后總黃酮質(zhì)量濃度1.0 mg·mL-1較相同濃度下的VC對(duì)ABTS+·的清除率減少了1.93%，差異不顯著。

圖3 純化前后總黃酮和Vc對(duì)自由基清除能力Fig.3 Free radical scavenging ability of total flavonoids before and after purification and Vc

2.5.3清除·OH能力 由圖3C可知，苜?？傸S酮粗提物與純化物都具有較強(qiáng)的清除·OH基能力，隨苜蓿總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增大。當(dāng)粗提物、純化物和VC的濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH的清除率分別為26.18%，66.52%和77.94%，粗提物、純化物和和VC的濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，較濃度為0.2 mg·mL-1對(duì)·OH的清除率分別增加了241.60%，40.57%和11.70%。在純化前后總黃酮質(zhì)量濃度低于0.6 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)·OH的清除率低于VC，但當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.8 和1.0 mg·mL-1時(shí)，純化后的總黃酮對(duì)·OH的清除率高于VC，分別增加了3.52%和6.90%。

3 討論

3.1 大孔樹(shù)脂對(duì)苜?？傸S酮純化效果的影響

大孔樹(shù)脂在植物生物活性成分分離純化研究中具有良好的吸附性和反復(fù)利用等特點(diǎn)，通過(guò)物理作用將黃酮類物質(zhì)吸附在自身孔隙中，從而達(dá)到有效分離純化的目的[16]。前人在純化苜?？傸S酮的研究中，選擇了具有不同性質(zhì)的大孔樹(shù)脂，陳佩佩和荊常亮認(rèn)為苜蓿總黃酮的純化中，AB-8和D101大孔樹(shù)脂有較好的吸附和解吸附效果，對(duì)苜?？傸S酮的純化效果比較好，與本研究在大孔樹(shù)脂篩選的結(jié)果基本一致；本研究篩選的苜?？傸S酮上樣液質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1，與他們?cè)谏蠘右嘿|(zhì)量濃度為0.528 mg·mL-1和0.6 mg·mL-1有較大的差異；上樣體積選擇上，不同的學(xué)者研究結(jié)果差異比較大，荊常亮選擇了4 BV和陳佩佩選擇了3 BV，而本研究篩選的結(jié)果為2 BV，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)高的上樣體積影響了吸附的效果，流速越慢越利于樹(shù)脂吸附苜?？傸S酮；在上樣液pH值選擇上，與前人的研究所選pH值多為3～4結(jié)果一致，說(shuō)明紫花苜?？傸S酮這種弱酸性物質(zhì)在酸性環(huán)境中有很好的吸附效果[17]。本研究在確定上樣液質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1，上樣體積為2 BV，上樣液pH值為3的純化參數(shù)條件下，苜?？傸S酮純度可達(dá)到 31.46%，與荊常亮用AB-8大孔吸附樹(shù)脂富集紫花苜蓿總黃酮后純度可達(dá)33.03% 結(jié)果相近，與陳佩佩純化獲得純化率48.52%差異比較大，苜蓿總黃酮的分離純化過(guò)程中受各種因素的影響，導(dǎo)致人們?cè)诩兓俎？傸S酮時(shí)產(chǎn)生較大的差異。

3.2 苜?？傸S酮對(duì)自由基清除能力的影響

4 結(jié)論