李囡 孔祥照 古同男 駱雨辰 鄢雯

(首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)學(xué)系,北京 101300)

近年來，缺血性心臟病患病率及死亡率持續(xù)上升，嚴(yán)重危害人類健康[1]。溶栓療法、介入療法和動脈搭橋術(shù)等能及時恢復(fù)缺血心肌的血液灌流，是防治心臟缺血損傷的最有效的措施。然而，缺血心肌在恢復(fù)血液灌流后，可引起超微結(jié)構(gòu)、功能及電生理方面發(fā)生進(jìn)一步的損傷，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[2]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)誘導(dǎo)活化后啟動細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞粘附分子等炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，引起缺血再灌注組織的炎癥反應(yīng)[3]。蛋白酶體抑制劑可通過抑制泛素-蛋白酶體途徑，抑制NF-κB抑制蛋白(IκB)的降解，從而抑制NF-κB的激活[4-5]。MG132是一種常用的蛋白酶體抑制劑，可誘導(dǎo)凋亡蛋白表達(dá)、抗腫瘤增殖、抗炎癥、促進(jìn)熱休克蛋白表達(dá)。MG132能否通過抑制 NF-κB的激活，降低炎癥介質(zhì)的表達(dá)改善心肌缺血再灌注損傷，目前報道尚少。本研究以分離培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞為研究對象，建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型，在細(xì)胞水平探討MG132對抗H/R損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。報告如下。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 新生1 d的SD大鼠，雌雄不限(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)；MG132購自美國Selleck公司；DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Hyclone公司；LDH乳酸脫氫酶檢測試劑盒和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；CCK-8試劑盒購自日本dojindo公司；p-IκB、IκB、p-P65、P65、GAPDH抗體購自美國cell signaling technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠/兔IgG購自北京中杉金橋生物公司；層粘連蛋白(Lamnin)購自BD公司；Sigma膠原酶II、胰酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒購自美國Sigma公司；RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白標(biāo)記物、BCA 蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；PVDF 膜和ECL 試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2實驗方法

1.2.1原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取24 h內(nèi)出生的SD大鼠乳鼠的心臟，將心臟剪成約1 mm3的組織小塊，加入混合消化酶，5 mL/次，37 ℃水浴鍋中緩慢搖動消化，2 min/次。用移液管將單細(xì)胞懸液移至含有15 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，以終止消化。上述過程重復(fù)直至組織塊消化完全。收集所有消化所得的細(xì)胞，用200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，1000 rpm/min，離心10 min，棄上清，用15 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸沉淀，反復(fù)輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，差速貼壁60 min。收集上清中的心肌細(xì)胞，按照每孔5×104個細(xì)胞接種于Laminin預(yù)包被的無菌6孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后換液，48 h后，心肌細(xì)胞平鋪成單層并同步化跳動，可用來后續(xù)實驗。

1.2.2建立大鼠心肌細(xì)胞H/R損傷模型 待提取的SD大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，棄去原完全培養(yǎng)基，置換為無血清無糖的缺氧液(139 mmol·L-1NaCl、4.7mmol·L-1KCl、0.5 mmol·L-1MgCl2、1.0 mmol·L-1CaCl2、5 mmol·L-1HEPES，pH 7.4)，將細(xì)胞置于缺氧小室中，放入37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，即為缺氧。然后把原培養(yǎng)液吸除后，加入10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基，放在37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即為復(fù)氧[6]。

1.2.3細(xì)胞實驗及分組 將SD大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組: 正常對照組、H/R組、MG132組、MG132+ H/R組。對照組細(xì)胞不經(jīng)缺氧復(fù)氧處理；MG132組加入MG132，不經(jīng)缺氧復(fù)氧處理；H/R組經(jīng)缺氧復(fù)氧處理；MG132+ H/R組加入MG132后培養(yǎng)24 h，進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。各組結(jié)束以后檢測以下指標(biāo)。

1.2.4心肌細(xì)胞活性的檢測 將SD大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)量為104個，加入培養(yǎng)基100 μL，按上述方法進(jìn)行分組及處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h 后，酶標(biāo)儀測定A450，空白對照孔為不含細(xì)胞的培養(yǎng)液。實驗測定孔吸光度減去空白對照孔吸光度為心肌細(xì)胞活力，計算各組平均值。

1.2.5LDH水平的檢測 用二硝基苯肼法測定培養(yǎng)液上清中LDH活性。將大鼠心肌細(xì)胞按上述方法進(jìn)行分組及處理后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，用試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.6TUNEL染色 將大鼠心肌細(xì)胞按上述方法進(jìn)行分組及處理后，細(xì)胞以4 %多聚甲醛-PBS液室溫下固定30 min，TBS洗滌；2 % H2O2-甲醇液室溫30 min，TBS洗滌；通透液冰浴2 min，TBS洗滌；按TUNEL試劑盒說明操作染色。

1.2.7RT-PCR法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平 取各組心肌細(xì)胞，按照TRIzol 法提取細(xì)胞中的RNA，紫外分光光度計測定A260和A280值，測定RNA質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用RT- PCR法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平。內(nèi)參GAPDH的上游引物為5’-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’，下游引物為5’- GGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3’；IL-1β上游引物為5’-CTTCCCCAGGGCATGTTAAG -3’，下游引物為5’-ACCCTGAGCGACCTGTCTTG-3’；IL-6上游引物為5’-TTCCATCCAGTTGCCTTCTTG-3’，下游引物為 5’-TTGGGAGTGGTATCCTCTGTGA-3’；TNF-α上游引物為5’-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTG-3’，下游引物為5’- GTTAGAAGGACACAGACTGG-3’。反應(yīng)程序為：94 ℃，預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，40個循環(huán)。

1.2.8Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平 心肌細(xì)胞接種于6孔板中，分組處理細(xì)胞。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍。然后加150 μl裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞至1.5 mL EP管中，用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲1遍，放于冰上孵育30 min，12 000 rpm，4 ℃，離心15 min。取上清，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。每組取30μg 蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5 % BSA 室溫封閉1 h 后以1:1 000分別加入一抗，4 ℃過夜，TBST 沖洗后以1:5 000加入二抗室溫孵育120 min，ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Image J 圖像分析軟件測定目的蛋白條帶的灰度值，并與內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1MG132對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL檢測結(jié)果顯示，對照組幾乎無凋亡陽性細(xì)胞核，H/R組凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)量明顯增加，H/R+MG132組凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)量明顯減少(Fig.1A)。定量分析結(jié)果表明(Fig.1B)，與對照組比較，H/R 組心肌細(xì)胞凋亡率均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與 H/R 組比較，H/R+MG132組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明MG132缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。

圖1 MG132減少缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL，200×)

2.2MG132對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響 我們采用CCK-8法測定了大鼠心肌細(xì)胞生存率。與對照組相比，H/R組導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，給予MG132處理能提高乳鼠心肌細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見Fig 2)。以上結(jié)果表明，MG132對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞具有直接保護(hù)作用。

圖2 各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡和存活率的變化

2.3MG132對缺氧復(fù)氧處理后心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響 乳酸脫氫酶是代表組織或細(xì)胞受到損傷的一個指標(biāo)，在實驗中給予不同濃度的H2O2后，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2的含量，以評價H2O2刺激對細(xì)胞損傷的影響[7]。結(jié)果如Fig 3 所示。與Control 組相比，H/R組LDH值升高，表明缺氧/復(fù)氧對心肌細(xì)胞造成損傷，H/R+MG132組與H/R組相比，LDH值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明MG132對缺氧/復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞損傷均具有較好的保護(hù)作用。

圖3 LDH活性檢測分析結(jié)果

2.4MG132對缺氧/復(fù)氧后IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平的影響 炎癥與心肌細(xì)胞功能失調(diào)的發(fā)生密切相關(guān)。因此我們研究了MG132在心肌細(xì)胞H/R損傷后炎癥反應(yīng)中的作用。Real-time PCR 結(jié)果顯示H/R組IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯高于Control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。H/R+MG132組炎癥因子 IL-1β、IL-6 和TNF-α的mRNA水平明顯低于H/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明缺氧/復(fù)氧能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，而MG132能夠抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中促炎因子的表達(dá)。

圖4 MG132對缺氧/復(fù)氧處理后心肌細(xì)胞中IL-1β,IL-6 和 TNF-α mRNA表達(dá)的影響

2.5MG132對缺氧復(fù)氧處理后心肌細(xì)胞中NF-κB信號通路表達(dá)的影響 用MG132作用大鼠心肌細(xì)胞24 h后，進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，檢測MG132對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中NF-κB信號通路表達(dá)的影響，結(jié)果如Fig 5所示。與對照組相比，H/R組p-IκB和p-P65表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。MG132作用后p-IκB和p-P65表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 MG132對缺氧/復(fù)氧處理后心肌細(xì)胞中IκB和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

缺血再灌注損傷是由多種因素互相影響、互相促進(jìn)而形成的病理生理過程，目前認(rèn)為主要與下列因素相關(guān)：氧自由基生成增多引起氧化應(yīng)激；細(xì)胞因子、黏附分子等炎癥介質(zhì)的合成與釋放；炎性細(xì)胞的浸潤與激活。上述因素共同引起組織及細(xì)胞能量代謝及細(xì)胞膜功能的紊亂，并最終引起組織損傷和細(xì)胞凋亡。大量的證據(jù)顯示急性炎癥反應(yīng)是I/R損傷的中心環(huán)節(jié)，缺血/再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)包括黏附分子的誘導(dǎo)表達(dá)，炎性細(xì)胞的浸潤，以及細(xì)胞因子的釋放等，而核因子-κB(NF-κB)是調(diào)節(jié)諸多炎癥介質(zhì)表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子[8]。

NF-κB是真核細(xì)胞中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞增殖與凋亡等多種生理、病理過程的基因調(diào)控[8-9]。在正常情況下，NF-κB通常以異源二聚體NF-κB1/RelA(P50-P65)的形式與抑制性因子IκB(inhibitor of κB，IκB)結(jié)合形成三聚體(P65-P50-IκB)，以無活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)中[9]。當(dāng)細(xì)胞受到缺血再灌注、細(xì)胞因子、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)菌、病毒等刺激時，IκB蛋白被IκB激酶(IκB kinase，IKK)磷酸化并由多聚泛素鏈標(biāo)記，從而被26S蛋白酶體識別并降解，致NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，這一過程可被蛋白酶體抑制劑所阻斷[5,9,10]。研究表明，炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用，而NF-κB的誘導(dǎo)活化，從而促進(jìn)一系列基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，是缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。在缺血再灌注過程中起重要作用的細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6)的基因調(diào)控序列中均含有κB 位點(diǎn)，受NF-κB調(diào)控[11-12]。

泛素一蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細(xì)胞內(nèi)80 %以上蛋白質(zhì)的降解?，F(xiàn)有研究表明抑制蛋白酶體活性能夠通過抑制 NF-κB 的激活，減少“下游”炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而改善肝、腎等器官缺血再灌注損傷的組織損傷[13-14]。MG132是一種醛基肽類蛋白酶體抑制劑，能夠抑制26S蛋白酶體的活性。研究表明，MG132通過減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，改善腦、腎、肝等組織缺血再灌注損傷[15-16]。在高血糖缺血再灌注模型中，MG132通過減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕心肌細(xì)胞損傷[17]。

我們的實驗結(jié)果表明：H/R組與對照組相比，心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，細(xì)胞存活率明顯降低，LDH活性明顯升高，提示缺氧/復(fù)氧確實引起了心肌細(xì)胞的損害。H/R+MG132組與H/R組相比，細(xì)胞凋亡率和LDH活性明顯降低，細(xì)胞存活率明顯升高，說明缺氧前預(yù)防性使用MG132可以改善心肌細(xì)胞的H/R損傷。Western blot方法檢測心肌細(xì)胞中活性NF-κB的表達(dá)情況：結(jié)果顯示H/R組較對照組

表達(dá)明顯升高，而H/R+MG132組表達(dá)較H/R組明顯降低。采用RT-PCR法檢測心肌細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)情況也得到類似結(jié)果。實驗結(jié)果提示心肌細(xì)胞的H/R過程確實能激活NF-κB，IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)也相應(yīng)增加，導(dǎo)致細(xì)胞損傷；而MG132能抑制對磷酸化、泛素化的IκB的降解作用，從而抑制NF-κB的活化，繼而降低NF-κB 調(diào)控的IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，改善H/R。

綜上所述，蛋白酶體抑制劑MG132在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧過程中有重要的保護(hù)作用。其機(jī)制為：MG132通過抑制蛋白酶體活性，抑制了IκB在泛素-蛋白酶體途徑中的降解，減少了活性NF-κB的生成，降低多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，減輕H/R對心肌細(xì)胞的損傷，為臨床防治缺血/缺氧性心肌損害提供了參考。