敖琴 李龍△ 劉俊 李俊媛 李培霆

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院風濕免疫科，貴州 貴陽 550004；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院感染科，湖北 武漢 430022)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種病因不明的慢性自身免疫性疾病，病變主要位于四肢小關節(jié)，隨著疾病發(fā)展，可累及全身各個系統(tǒng)，其中ILD是最常見的關節(jié)外改變。RA患者中有2%～10%可發(fā)展為類風濕性關節(jié)炎間質性肺疾病(rheumatoid arthritis- interstitial lung disease ,RA-ILD)[1]；近年來RA的總體死亡率有所下降，但ILD卻成為RA患者主要死亡原因之一，并呈逐年上升趨勢，占所有RA相關死亡的7-13%[2]。RA-ILD表現(xiàn)為肺部不同程度的炎癥和纖維化活動，該過程被認為是漸進的，并在很大程度上不可逆轉，其中常見的病理類型為普通間質性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)和非特異間質性肺炎(non-specific interstitial pneumonia,NSIP)，而UIP在RA-ILD中最常見，表現(xiàn)為明顯的致密纖維化和肺結構重塑[3]。目前多數(shù)觀點認為，ILD是由遺傳和環(huán)境因素共同造成，但具體病因和發(fā)病機制尚不清楚；臨床上大多數(shù)患者在肺部出現(xiàn)明顯癥狀、肺功能顯著受損后才被明確診斷，這對于RA-ILD的早期識別及延緩疾病進展是一項艱巨的挑戰(zhàn)[4]。要想進一步深入研究，選擇合適的動物模型是實驗進展的關鍵步驟。而UIP作為RA-ILD中最常見的病理類型，所以在造模過程中，通常參考UIP動物模型的造模方法。報告如下。

1 博來霉素誘導

博來霉素(bleomycin,BLM)為鏈霉菌中提取出來的一種細胞毒性藥物，在臨床上被作為抗腫瘤藥物使用，因其副作用可導致肺纖維化，所以在研究類風濕性關節(jié)炎相關間質性肺疾病發(fā)病機制方面，常采用BLM誘導的肺纖維化動物模型[5]。BLM的給藥方式包括氣管內給藥、霧化、尾靜脈注射、腹腔注射等，目前常用的方法為氣管內給藥[6-7]。有研究比較了氣管內灌注和Penncentur動物霧化器氣管內霧化兩種方法結果顯示，Penncentur霧化器氣管內霧化造成的小鼠肺纖維化病灶分布更均勻，而且可降低繼發(fā)感染的風險，但與傳統(tǒng)口鼻暴露霧化吸入相比，Penncentur氣管內霧化操作復雜，費用較高[8]。而對于BLM的使用劑量，根據(jù)所選動物類型、藥物使用方式的不同，在劑量上的運用也存在著顯著差異，目前國內尚無確切的標準。BLM誘導的肺纖維化動物模型早期表現(xiàn)為間質性炎癥和血管損傷，晚期以肺間質纖維化形成為特點[9]。王鶴、Mahmutovic Persson等[10-11]均使用SD大鼠作為模型，通過連續(xù)氣管內灌注BLM的第3天，支氣管肺泡灌洗液的總蛋白量、炎性細胞以及血漿滲出量開始增加，肺組織Masson染色顯示肺間質開始出現(xiàn)紅細胞和部分炎細胞的浸潤，磁共振檢查肺部也出現(xiàn)了肺總體積增加；而在之后的第7、21、28天炎癥有所緩解，小鼠肺間隔呈中、重度增厚，肺泡結構消失，成纖維細胞及膠原基質的沉積顯著。 周平[12]也采用SD大鼠器官灌注BLM，在連續(xù)給藥的第7天小鼠肺組織HE染色后表現(xiàn)為急性炎癥損害病灶，第14天后炎癥有所緩解，但出現(xiàn)成纖維細胞的增生、肺泡結構破壞，第28天肺泡破壞嚴重，肺泡間隔大量膠原和纖維蛋白沉積。以上BLM誘導的病變主要集中在肺組織，其他器官暫未出現(xiàn)損傷表現(xiàn)。通過BLM誘導的間質性肺疾病，技術成熟，造模周期短，形成的間質性肺部疾病相對穩(wěn)定；然而與RA-ILD的不可逆性、緩慢進展性以及形成背景的特點相比，該方法雖具有強大的可重復性和通用性，但其本身仍不能確切的復制出RA-ILD，在還原其病理變化上仍有所不足[13]。

2 膠原誘導性關節(jié)炎模型

膠原誘導關節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)是目前最常用的類風濕性關節(jié)炎動物模型誘導方法，在很大程度上能復制出RA的病理狀態(tài)，且造模成功率較高，但在疾病模型的誘導中，關節(jié)外的病變研究相對較少，以常見的肺間質疾病為例，只有少部分研究描述了在膠原誘導關節(jié)炎的前提下，可發(fā)生肺部炎癥的變化。高波、Y.Terasaki[14-15]在利用CIA造模過程中，選擇恢復期小鼠提取肺組織染色發(fā)現(xiàn)肺部外周血存在大量正球形、著色較深的外周血淋巴細胞以及大量紅細胞，同時肺泡結構出現(xiàn)破壞，肺間隔增厚，毛細血管出現(xiàn)擴張，且TNFα、IL-6、IL-β的表達均明顯上升，結果具有統(tǒng)計學意義。E.Schurgers等[16]利用γ干擾素受體敲除小鼠在CIA的誘導下，于免疫后的第21天小鼠肺表面發(fā)現(xiàn)有巨噬細胞和中性粒細胞組成白色半透明斑塊，并且在血管周圍和細支氣管周圍出現(xiàn)大量淋巴細胞的浸潤，肺間質也含有類似于風濕結節(jié)的肉芽組織樣結構浸潤。之后Tomomi Sato[17]發(fā)現(xiàn)在首次免疫后的第7天，CIA小鼠胸膜下區(qū)開始出現(xiàn)炎性細胞的聚集，抗CCP抗體也在血清中被檢測到；免疫后第49天肺HE染色發(fā)現(xiàn)肺周圍，尤其胸膜下區(qū)域，炎癥細胞呈片狀間質浸潤，其中以M2表型的CD11b巨噬細胞增多為主，該表性的巨噬細胞可促進纖維化的發(fā)生；此外還有IgG和補體C3沉積、抗瓜氨酸纖維蛋白抗體(ACPAs)產生，但之后該肺部表現(xiàn)逐漸減弱，免疫后第105天和161天額外免疫也未出現(xiàn)膠原沉積，也未顯示明顯的纖維化跡象，第182天肺組織的炎性改變及膠原沉積不再被觀察到。通過CIA誘導的RA-ILD模型，雖然目前有關研究較少，但根據(jù)CIA小鼠肺部炎癥細胞的浸潤部位、補體和ACPAs滴度增高等表現(xiàn)來看，這種模型與人類RA-ILD明顯相似。只是目前認為CIA所導致的小鼠肺改變是可逆的，沒有進一步纖維化的跡象[18]。因此CIA模型造成肺部炎癥變化或許可作為RA-ILD早期發(fā)病機制研究模型建立基礎。

3 腫瘤壞死因子轉基因誘導模型

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是RA和肺疾病持續(xù)進展的關鍵細胞因子[19]。Cazlaris H等[20]曾在以C57BL/6CBA為背景下，獲得了腫瘤壞死因子轉基因(tumor necrosis factor transgenic,TNF-TG)小鼠，該過程為通過一個包含編碼整個人類TNF-α基因片段的靶向載體，其中含有ARE的3‘UTR被來自β-珠蛋白基因的3’UTR取代，植入這種靶向載體后，可增加TNF-α基因的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而通過全身過表達TNG-α，導致炎性侵襲性關節(jié)炎。有學者發(fā)現(xiàn)在TNF-TG小鼠模型中，除有典型的關節(jié)炎病變外，還存在著ILD，并且表現(xiàn)為慢性、漸進性改變，與人RA-ILD更為相似[21-22]。Richard D.Bell等[23]曾利用TNF-TG小鼠誘導出ILD，并采用肺微型計算機斷層掃描(MCT)小鼠肺組織，結果顯示TNF-TG小鼠在所有時間點的組織體積、總肺體積和平均強度都顯著增高。此外Emily K.Wu等[24]同樣曾利用TNF-TG小鼠誘導ILD，與正常對照組比較后提示TNG-TG小鼠的氣體交換能力受損，呼吸阻力增加，吸氣量顯著降低，肺順應性、彈性也均降低。然而該實驗沒在病變肺組織發(fā)現(xiàn)膠原沉積的改變，但在肺間質組織中存在明顯的炎性細胞聚集。與人RA-ILD的肺纖維化改變相比，TNF-TG模型雖不能完全描述臨床疾病的所有方面，但可用來闡釋TNF驅動的炎癥和間質性肺疾病間的關系。

4 其 他

除上述方法外，F(xiàn)U Yalu等[25]在CIA模型全身免疫反應的基礎上聯(lián)合BLM誘導小鼠間質性肺疾病，該模型呈現(xiàn)出全身慢性炎癥反應進行性肺纖維化持續(xù)加重的病理，與RA-ILD的臨床表現(xiàn)更為接近。而SKG小鼠，因編碼ZAP-70 SH2結構域的基因突變，可自發(fā)發(fā)生T細胞介導的慢性自身免疫性關節(jié)炎，通過腹腔注射酵母多糖的SKG小鼠可因自我耐受的破壞引起關節(jié)癥狀和ILD，因此亦可通過上述方法在該類型小鼠中研究自身免疫性關節(jié)炎背景下引起的ILD[26]。此外，也有利用基因工程手段來建立肺纖維化模型的研究，L.William E等[27]利用表面活性蛋白C(SFTPC)、表面活性蛋白-A2 (SFTPA2)、端粒酶逆轉錄酶(TERT)和端粒酶RNA(TERC)這四個基因來構建轉基因小鼠，再運用四環(huán)素誘導這些基因的表達系統(tǒng)的啟動或關閉，從而構建肺纖維化小鼠動物模型。

5 展 望

目前國內無論在研究RA-ILD還是其他原因所導致的肺間質纖維化，通常為單獨復制肺部病變的模型，如BLM誘導的肺纖維化模型仍然是最常用且相對成熟的方法，但值得注意的是與人RA-ILD相比，該病變只局限在肺組織，并未引起關節(jié)受損。CIA和TNF-TG小鼠誘導的模型可兼并關節(jié)炎和間質性肺疾病兩種疾病狀態(tài)，這更加接近人RA-ILD的病理改變，而且更符合RA-ILD早期發(fā)病是在炎性自身免疫條件下發(fā)生的機制特點。但不足之處在于上述模型的肺部病變程度普遍較輕，且通常為可逆性改變。因此，要想獲得構建相對簡易且經濟、全面反映人RA-ILD特征的動物模型，仍是亟需不斷深入研究的內容之一。