周俊亮，王賢珍，侯曉蕾，楊 瓊，陳 越，榮偉雅，劉 青，王偉偉，宋 晶，劉少貞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 031801；2.山西省水產(chǎn)技術(shù)推廣服務(wù)中心，山西 太原 030002）

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物 （endocrine disrupting chemicals，EDCs），又稱環(huán)境激素，是一類廣泛存在于自然環(huán)境中的具有類激素生物學(xué)效應(yīng)的化合物，能夠?qū)е聶C(jī)體內(nèi)分泌代謝失衡，引起生物機(jī)體繁殖損害［1-2］。 EDCs 來(lái)源廣泛且產(chǎn)量巨大，各種EDCs 通過(guò)人類的生產(chǎn)活動(dòng)不斷釋放到環(huán)境中，最終進(jìn)入水體［3-4］。 再加上EDCs 具有不易降解和殘留期長(zhǎng)等特點(diǎn)，可以在生物體內(nèi)大量富集，對(duì)動(dòng)物的發(fā)育和生殖功能造成巨大的危害［5-6］。

17α-甲基睪酮 （17α-methyltestosterone，MT）化學(xué)名17α-甲基-17β-羥基雄甾-4-烯-3-酮，是一種人工合成的白色粉末狀具有雄激素效應(yīng)和作用的化合物，是最具代表性的環(huán)境雄激素之一［7-8］。MT 是天然雄激素睪酮（testosterone，T）的17-α 位甲基衍生物， 可引起機(jī)體肝臟損傷等， 高濃度的MT 可引起魚類生長(zhǎng)及發(fā)育異常［9］。 由于MT 具有廣泛應(yīng)用以及難降解的特性， 大量存在于水環(huán)境中，在世界范圍內(nèi)的水環(huán)境中均有檢出，因此，在2002 年MT 就被列為禁用藥物［10］。MT 的作用模式存在兩種假說(shuō)： ①直接通過(guò)模擬體內(nèi)天然雄激素與雄激素受體（AR）結(jié)合，影響多種激素的合成和釋放。②間接抑制芳香化酶活性，從而引起機(jī)體內(nèi)性類固醇激素水平的改變， 引起魚類性腺發(fā)育不良甚至發(fā)生性逆轉(zhuǎn)［11］。

DNA 甲基化是DNA 分子CpG 島的胞嘧啶（C）第5 位碳原子上加一個(gè)甲基，使C 變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC），從而對(duì)DNA 進(jìn)行修飾［12］。 DNA甲基化在動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)、 發(fā)育和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等方面起關(guān)鍵作用［13］。DNA 甲基化主要由DNMTs（編碼基因：dnmt1、dnmt3、dnmt4、dnmt5、dnmt6、dnmt7、dnmt8）和TETs（編碼基因：tet1、tet2、tet3）兩個(gè)酶及一個(gè)底物即甲基供體S-腺苷蛋氨酸（Sadenosyl-L-methionine，SAM）調(diào)控［14］。 哺乳動(dòng)物有3 種DNMTs：DNMT1、DNMT2 和DNMT3［15］。DNMT1 起維持DNA 甲基化的作用， 在細(xì)胞分裂中復(fù)制甲基化［16］。 DNMT2 目前研究較少，可能與RNA 甲基化有關(guān)［15］。 DNMT3 參與DNA 從頭甲基化過(guò)程，能夠在DNA 的某些區(qū)域引入新的甲基［14］，包括DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L。而有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內(nèi)DNMT3 家族有DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7 和DNMT8 6 種不同的亞型［17］。

EDCs 可以引起基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA 甲基化的改變，影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［18］。 前期研究表明，雌二醇（EE2）和甲基睪酮（MT）能夠改變稀有鮈鯽精巢和卵巢cyp17a1 啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平，影響cyp17a1 的表達(dá)［19］。DNA 甲基化水平變化的同時(shí)dnmts 表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變，1 mg/L 的雙酚A（BPA）暴露斑馬魚（Danio rerio）可引起斑馬魚性腺DNA 甲基化水平的降低和基因dnmt1 表達(dá)量的下降［20］，dnmts 表達(dá)可以直接對(duì)DNA 甲基化進(jìn)程產(chǎn)生影響，因此，dnmts 調(diào)控是調(diào)節(jié)DNA 甲基化的重要途徑。

稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）屬鯉科鮈鯽屬，是我國(guó)特有物種，個(gè)體全長(zhǎng)3～8 cm［21］。稀有鮈鯽具有飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、繁殖快、對(duì)環(huán)境污染和化學(xué)品敏感等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、生理學(xué)、生物監(jiān)測(cè)、毒性測(cè)試等領(lǐng)域， 是我國(guó)迄今發(fā)現(xiàn)的最適合作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的魚類［22-24］。 大量研究表明，稀有鮈鯽對(duì)EDCs 十分敏感，BPA、EE2、苯并芘（BaP）等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物會(huì)擾亂稀有鮈鯽的生殖過(guò)程［19，25-26］。稀有鮈鯽是2010 年中華人民共和國(guó)生態(tài)環(huán)境部《新化學(xué)物質(zhì)申報(bào)登記指南》中指定的本土實(shí)驗(yàn)生物［27］。

該研究選擇稀有鮈鯽雄魚為研究對(duì)象， 研究不同濃度MT 對(duì)稀有鮈鯽精巢中DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響， 以期為MT 影響稀有鮈鯽精巢發(fā)育及精子成熟的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室繁殖的同一批6 月齡稀有鮈鯽 （G. rarus）雄魚，從中挑選體格勻稱且健康的平均體長(zhǎng)（3.45±0.25）cm、平均體重（0.71±0.09）g 的個(gè)體作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

17α-甲基睪酮 （MT， 純度＞99%） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。RNA 提取試劑（RNAiso Plus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（TB GreenRPremix Ex TaqTMⅡ）購(gòu)自日本TaKaRa 公司。 核酸蛋白檢測(cè)儀（ND1000，NanoDrop 公司），PCR 擴(kuò)增儀（ABI公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX ConnextTMReal-Time System，Bio-Rad 公司）等。

1.3 MT 處理稀有鮈鯽雄魚

試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)組，1 個(gè)對(duì)照組和3 個(gè)MT 處理組（25、50 和100 ng/L），對(duì)照組為0.001%（V/V）無(wú)水乙醇水溶液， 各組均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。 每個(gè)缸里36 尾稀有鮈鯽雄魚。 該試驗(yàn)采用半靜水暴露的方法，養(yǎng)殖用水pH 值為7.6 左右。 保證飼養(yǎng)密度小于1 g 魚/L 水，每天吸污（殘餌和糞便）的同時(shí)換掉水族箱一半的水， 并加入等量的水和相應(yīng)量的MT 溶液，保證水族箱里MT 濃度不變。 每天早晚定量投喂紅蟲各1 次。 試驗(yàn)期間保持養(yǎng)殖環(huán)境安靜， 減少試驗(yàn)魚的應(yīng)激反應(yīng)， 水溫控制在 （25±1）℃，光周期14 h∶10 h（明/暗）。

1.4 取樣

分別在7、14 和21 d 暴露結(jié)束后， 對(duì)各組稀有鮈鯽進(jìn)行解剖，取樣前一天晚上停止喂食，保證取樣當(dāng)天稀有鮈鯽處于空腹?fàn)顟B(tài)。 每次隨機(jī)撈取10 尾魚，采用MS-222 將魚麻醉后，摘取稀有鮈鯽精巢（n=10）放在Trizol 里研磨并充分裂解，隨后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總RNA 提取及cDNA 的合成

采用Trizol 一步法提取稀有鮈鯽精巢總RNA，以總RNA 為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書合成cDNA。

1.6 定量引物合成

參考劉琰［26］的研究合成稀有鮈鯽dnmt1、dnmt3、dnmt4、dnmt5、dnmt6、dnmt7、dnmt8 以及內(nèi)參基因β-actin 的定量引物（見表1）；首先使用普通PCR 檢測(cè)引物擴(kuò)增條帶，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，無(wú)二聚體，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列［26］

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的表示方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）， 目的基因的表達(dá)量為相對(duì)表達(dá)量，用F=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計(jì)算。 使用IBM SPSS Statistics 21.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

MT 處理稀有鮈鯽雄魚7 d，dnmt1、dnmt4、dnmt6、dnmt8 基因相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著變化 （見圖1A、C、E、G）； 與對(duì)照組相比，25 ng/L 和100 ng/L的MT 處理組，dnmt3 基因相對(duì)表達(dá)量顯著 （P＜0.05） 降低，50 ng/L 的MT 處理組稀有鮈鯽精巢dnmt3 基因相對(duì)表達(dá)量極顯著（P＜0.01）降低（見圖1B）；25 ng/L 和50 ng/L 的MT 處理組，dnmt5 基因相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）降低（見圖1D）。 dnmt7基因相對(duì)表達(dá)量只在50 ng/L 的MT 處理組顯著（P＜0.05）降低（見圖1F）。

MT 處理稀有鮈鯽雄魚14 d，25 ng/L 的MT 處理組，所有基因表達(dá)量無(wú)變化（見圖1）。50 ng/L 的MT 處理組dnmt1 基因相對(duì)表達(dá)量極顯著 （P＜0.01） 升高 （見圖1A）。 100 ng/L 的MT 處理組，dnmt3、dnmt5、dnmt6、dnmt7 基因相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）升高（見圖1B、D、E、F）。

MT 處理稀有鮈鯽雄魚21 d， 與對(duì)照組相比，50 ng/L 和100 ng/L 的MT 處理組dnmt1 基因相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）升高（見圖1A）；dnmt8 的mRNA 表達(dá)量極顯著（P＜0.01）升高（見圖1G）。

圖1 MT 對(duì)稀有鮈鯽精巢dnmts 基因表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究人員開始關(guān)注DNA甲基化在有毒物質(zhì)對(duì)機(jī)體影響中的調(diào)控作用［28-29］。DNA 甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA 構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA 與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)，在真核生物中，CpG 島上第5 位胞嘧啶堿基上的甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化的［30］。 表觀遺傳機(jī)制可以深刻地改變轉(zhuǎn)錄和翻譯的生物學(xué)過(guò)程， 在調(diào)節(jié)生物體對(duì)毒物的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［29-30］。 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs） 是調(diào)控DNA 甲基化主要酶類，DNMTs酶活性的變化會(huì)引起DNA 甲基化水平的改變，而DNMTs 是由dnmts 基因編碼的［30］，用二氯酚暴露金魚后，肝臟的總DNA 甲基化水平升高，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）mRNA 水平的上調(diào)，說(shuō)明dnmts基因表達(dá)量的升高會(huì)使DNMTs 酶活性增強(qiáng)，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA 甲基化水平升高［31］。該研究結(jié)果表明短期MT 暴露（7 d），稀有鮈鯽精巢dnmt3 和dnmt5 容易受到影響，這說(shuō)明dnmt3 和dnmt5 對(duì)外源性雄激素較為敏感。任何因素導(dǎo)致的DNMTs 酶活性的變化可能引起DNA 甲基化水平的改變［32］，由此推測(cè)MT 可以通過(guò)改變dnmts 基因表達(dá)從而影響DNMTs 酶活性，進(jìn)一步影響稀有鮈鯽精巢發(fā)育及精子成熟。

研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸二乙基己酯 （DEHP）暴露大鼠會(huì)顯著提高子代大鼠睪丸的DNA 甲基化水平和dnmts 表達(dá)，引起子代大鼠睪丸發(fā)育不全［33］。環(huán)境相關(guān)濃度BPA 暴露斑馬魚， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)dnmt1的表達(dá)降低以及總體DNA 甲基化水平降低［34］。在對(duì)羅非魚（Oreochromis mossambicus）的研究中發(fā)現(xiàn)，dnmts 家族具有高度的保守性， 且在精巢中高度表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑顯著下調(diào)羅非魚性腺dnmts 基因表達(dá)， 說(shuō)明了甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑通過(guò)抑制dnmts 基因表達(dá)而抑制DNMT 酶活性，進(jìn)而降低羅非魚性腺DNA 甲基化水平［35］。 阿特拉津（atrazine）處理鯉魚（Cyprinus carpio）會(huì)使得性腺dnmts 基因mRNA 和整體DNA 甲基化水平降低［36］。環(huán)境雌激素雙酚A 處理斑馬魚，處理組性腺中dnmt1 和dnmt3 基因相對(duì)表達(dá)量升高，性腺整體甲基化水平升高， 從而抑制類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步增加卵巢中細(xì)胞凋亡，抑制卵細(xì)胞成熟［22］。綜上所述，不同類型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物通過(guò)影響性腺中dnmts 基因表達(dá)，而影響性腺甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT 活性， 進(jìn)一步影響性腺發(fā)育。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，MT 可以改變dnmts 基因mRNA 表達(dá)。MT 是否可以通過(guò)影響DNMT 酶活性而影響精巢DNA 甲基化水平，進(jìn)而抑制稀有鮈鯽精巢發(fā)育及精子成熟，需要驗(yàn)證。