李曉奇，王鳳武，韓健健

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.通遼市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

抗菌藥物耐藥性 （antimicrobial resistance，AMR） 是當(dāng)今社會受到廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生安全問題。 AMR 是由抗菌藥物濫用或低劑量持續(xù)使用引起的［1］。 近幾年，美國獸醫(yī)協(xié)會、歐洲獸醫(yī)聯(lián)合會發(fā)布了關(guān)于合理使用抗菌藥物的聯(lián)合聲明以及獸用抗菌劑使用指南。此外，世界各地的許多機構(gòu)正在努力減少抗菌藥物的總體使用量。 研發(fā)和設(shè)計替代抗生素的生物制劑治療病原微生物感染是當(dāng)前臨床的迫切需要。

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在再生醫(yī)學(xué)中被作為工程組織的原材料或作為治療炎癥疾病的免疫調(diào)節(jié)劑［2］。最近研究表明，MSCs已顯示出作為解決AMR 的問題的潛力。 MSCs 具有抗菌特性， 能夠分泌與病原體直接作用的抗菌分子以及增強宿主免疫細胞抗菌活性的因子［3-4］。研究證明，MSCs 與現(xiàn)有的抗菌藥物治療方法顯示出強大的協(xié)同作用，可以作為抗菌、抗病毒及抗寄生蟲藥物的替代物。MSCs 在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出一定的抗菌作用。 因供體物種和目標(biāo)細菌種類不同，關(guān)于MSCs 的抗菌作用，研究文獻中涉及許多不同的機制［5］。 此外， 其他因素會進一步影響MSCs 表型。 研究人員采用多種預(yù)處理方法，包括缺氧、血清剝奪和暴露于拮抗物質(zhì)，以提高MSCs分化或調(diào)節(jié)免疫細胞的能力。 目前研究主要通過MSCs 接觸細胞因子、目標(biāo)細菌、細菌成分、維生素和抗菌藥物探究其促進抗菌活性的條件， 從而改善其直接和間接的抗菌效果［6］。如果MSCs 的抗菌特性可以轉(zhuǎn)化為可行的治療選擇， 它們就可以取代目前用于動物的大部分抗菌藥物。筆者對MSCs影響細菌存活的作用機制以及抗菌藥物可能對MSCs 功能產(chǎn)生的影響等方面的研究進展進行綜述，以期為進一步闡明MSCs 抗菌作用機制、挖掘MSCs 作為治療細菌感染性疾病新方法的潛力提供參考。

1 MSCs 抗菌作用的直接機制

1.1 MSCs 分泌抗菌肽發(fā)揮抗菌作用

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是MSCs發(fā)揮抗菌功效的關(guān)鍵組成部分。AMPs 是成簇共表達的短氨基酸鏈，對細菌、酵母菌、真菌和癌細胞具有天然防御功能。 目前存在超過1 200 種已知的AMPs， 它們由從原核生物到高等動物的生物體產(chǎn)生。 AMPs 主要通過破壞微生物細胞膜殺滅微生物。此外，AMPs 還能調(diào)節(jié)宿主先天免疫細胞功能， 對微生物入侵進行防御。 已鑒定出幾種AMPs 由MSCs分泌，主要有導(dǎo)管素（cathelicidins）、β-防御素（β-defensin）、 脂質(zhì)運載蛋白2 （lipocalin2） 以及吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）。

導(dǎo)管素是一個主要的AMPs 家族， 在先天免疫中具有突出的作用。 導(dǎo)管素會導(dǎo)致細菌細胞膜破壞和細胞裂解［7］。導(dǎo)管素LL-37 與MSCs 對細菌的直接殺傷作用有關(guān)［8］。LL-37 具有殺菌特性以及在膿毒癥模型中降低細胞因子和內(nèi)毒素水平的能力。 研究顯示LL-37 對體內(nèi)外MSCs 抗菌活性至關(guān)重要。 進一步研究發(fā)現(xiàn)， 脂肪來源的MSCs 的LL-37 活性依賴于1，25-二羥基VD3。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，相對于MSCs，1，25-二羥基VD3補充劑增強了LL-37 的產(chǎn)生， 而用VD 受體抑制劑處理會使抗菌反應(yīng)無效。 同種異體小鼠MSCs 的體內(nèi)研究也表明導(dǎo)管素是殺死細菌的關(guān)鍵AMPs 之一［9］。導(dǎo)管素通過TLR2/4-IRAK4 依賴性途徑起作用，以建立有效殺死分枝桿菌的方法［10］，但是，結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)產(chǎn)生一種生存機制， 可以通過下調(diào)CAMP 基因表達破壞該途徑， 并抑制骨髓來源MSCs 的抗菌作用。

β-防御素是富含半胱氨酸的陽離子蛋白，大小從18 到145 個氨基酸不等。這些分子在細菌細胞膜中形成孔，導(dǎo)致細菌裂解［11］。 在人源MSCs 的研究中并不總是能夠檢測到β-防御素。 研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 暴露于銅綠假單胞菌、 金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌后不存在β-防御素2 或β-防御素3，所有殺菌作用歸因于LL-37 的釋放。相反，Sung等［12］在銅綠假單胞菌刺激和未刺激的MSCs 中鑒定出了人類β-防御素2。其他研究人員通過TLR-4 信號傳導(dǎo)從人源MSCs 中發(fā)現(xiàn)β-防御素分泌是大腸桿菌暴露后旁分泌體外抗菌作用的關(guān)鍵機制。 研究還顯示在小鼠模型中經(jīng)大腸桿菌處理的MSCs 可分泌類似的β-防御素。在奶牛中，除NK-賴氨酸外，β-防御素4A（bBD-4A）的AMPs 相關(guān)基因（NK1）表達在胎兒MSCs 中被發(fā)現(xiàn)，但未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管素2、鐵調(diào)素和IDO 的基因表達［13］。 MSCs 與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)增加了bBD-4A 和NK1 基因表達。

脂質(zhì)運載蛋白2 是一種AMPs，通過螯合含鐵載體發(fā)揮作用，剝奪細菌的鐵質(zhì)并限制其生長。在革蘭陰性細菌性肺炎小鼠模型體內(nèi)， 脂質(zhì)運載蛋白獲得高表達。 當(dāng)脂質(zhì)運載蛋白2 被阻斷時，MSCs 的細菌清除作用消失。脂質(zhì)運載蛋白2 的表達可以通過利用LPS 和TNFα 激活MSCs 而上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激可導(dǎo)致MSCs 中脂質(zhì)運載蛋白2 的表達增加［14］。 雖然AMPs 對MSCs 發(fā)揮抗菌作用很重要，但它們并不是唯一起作用的機制。

MSCs 中IDO 的表達參與對細菌的反應(yīng)。 IDO的作用是降低局部色氨酸水平， 從而誘導(dǎo)廣譜抗菌活性。 經(jīng)炎性細胞因子TNFα、IL1β 和IFNγ 刺激的MSCs，其IDO 表達上調(diào)，導(dǎo)致細菌生長減少。單獨使用TNFα 或IL1β 刺激MSCs 未能限制細菌生長，但2 種細胞因子都上調(diào)了IFNγ 介導(dǎo)的IDO活性。值得注意的是，添加IDO 抑制劑或色氨酸恢復(fù)了細菌的生長， 證實了IDO 是MSCs 發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵機制。 體內(nèi)研究尚未發(fā)現(xiàn)小鼠MSCs的IDO 表達。 由于缺乏IDO，鼠類MSCs 無法抑制金黃色葡萄球菌的細胞外生長， 但可有效抑制金黃色葡萄球菌的細胞內(nèi)生長。 巨細胞病毒能夠抑制IFN-γ 通路， 所以該病毒感染能夠抑制MSCs對細菌和寄生蟲的殺傷能力［15］。 另有研究發(fā)現(xiàn)，IDO 表達的上調(diào)可以通過暴露于TLR3 激動劑poly I:C 實現(xiàn)［16］。

1.2 MSCs 直接降解細菌生物膜提高抗菌藥物的效果

生物膜是細菌產(chǎn)生的聚合物基質(zhì)， 導(dǎo)致細菌對消毒劑、抗菌藥物和免疫細胞的抵抗力增強。在臨床上， 生物膜使細菌對抗菌藥物的耐受性提高了100～1 000 倍。 最近研究表明，MSCs 具有分解生物膜的潛力。 MSCs 可通過降解生物膜層和增加抗菌藥物滲透提高常規(guī)抗菌藥物的功效。 Marx等［17］研究了MSCs 條件培養(yǎng)基對多種細菌的體外作用，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成和菌體生長受到抑制。 進一步研究表明， 在MSCs 條件培養(yǎng)基中檢測到了半胱氨酸蛋白酶， 發(fā)現(xiàn)其通過減少細胞外蛋白質(zhì)含量抑制生物膜形成， 并允許常規(guī)抗菌藥物更好地滲透。 這些研究揭示了MSCs 與抗菌藥物聯(lián)合治療細菌感染性疾病的潛力。

2 MSCs 抗菌作用的間接機制

2.1 MSCs 誘導(dǎo)巨噬細胞間接促進抗菌作用

MSCs 被證明具有通過旁分泌因子與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的能力。 巨噬細胞是關(guān)鍵的免疫參與者，在組織修復(fù)、體內(nèi)平衡維護和細菌自噬中發(fā)揮作用。 此外，巨噬細胞可被誘導(dǎo)為抗炎M2樣表型或促炎M1 樣表型。研究證實，受感染組織中激活的同種異體小鼠MSCs 具有誘導(dǎo)M2 樣巨噬細胞的能力， 而未經(jīng)處理的受感染組織具有M1 樣顯性巨噬細胞群。 對細菌的殺傷作用歸因于MSCs 誘導(dǎo)M1 樣巨噬細胞表型的能力。 未激活的MSCs 可誘導(dǎo)M1 樣和M2 樣巨噬細胞的混合群體。 未激活的人源MSCs 能夠以同樣的方式影響巨噬細胞表型， 在大鼠模型中誘導(dǎo)M2 樣和M1 樣巨噬細胞的混合群體。 MSCs 通過前列腺素E2（PGE2）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）對人巨噬細胞進行調(diào)節(jié)，加強其對細菌的有效吞噬作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 與巨噬細胞接觸可以優(yōu)化線粒體轉(zhuǎn)移， 盡管由于存在外泌體介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移， 但通過細胞松弛素B 阻斷MSCs 間超細細胞質(zhì)橋梁 （TNT） 的形成并沒有完全消除線粒體轉(zhuǎn)移。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，TNT 形成是MSCs 發(fā)揮抗菌功效所必需的，這意味著細胞接觸依賴性轉(zhuǎn)移是巨噬細胞極化的關(guān)鍵。 在使用人源MSCs 的嚙齒類動物模型中觀察到類似的結(jié)果，MSCs 增強了巨噬細胞對大腸桿菌的吞噬作用，并且添加內(nèi)毒素和TNFα 后巨噬細胞的吞噬活性進一步增強。Lee等［19］提出了另一種巨噬細胞刺激機制：在離體肺模型的單核細胞中發(fā)現(xiàn)同種異體人源MSCs 將角質(zhì)形成細胞生長因子（KGF）釋放到人單核細胞的KGF 受體上，從而增強細菌清除能力，并減少細胞凋亡。 其他研究確定了體外MSCs 釋放的高水平趨化因子CCL2 會誘導(dǎo)炎癥單核細胞的募集。 與未激活的MSCs 相比， 經(jīng)poly I:C 激活的MSCs 釋放了更高水平的CCL2。

2.2 MSCs 分泌細胞因子增強免疫細胞功能

研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 通過分泌IL-6、IL-8 和MIF細胞因子增強多形核中性粒細胞（PMN）對細菌的攝取。這些分子與中性粒細胞上的受體CXCR1 和CXCR2 結(jié)合，介導(dǎo)PMN 的募集和激活。 中性粒細胞還會產(chǎn)生中性粒細胞胞外陷阱（NET），這有助于防止細菌傳播和介導(dǎo)殺傷作用。 Chow 等［20］將未激活的或小鼠模型中的MSCs 與對照中性粒細胞相比，發(fā)現(xiàn)與經(jīng)poly I:C 激活的人源MSCs 條件培養(yǎng)基共孵育后，每個細胞產(chǎn)生的NET 面積增加。

2.3 MSCs 增強其他免疫細胞免疫調(diào)節(jié)特性

MSCs 已被證明可以增強其他免疫細胞的免疫調(diào)節(jié)特性。 經(jīng)牙齦卟啉單胞菌總蛋白提取物（PgPE）刺激的人牙周膜衍生MSCs（PDLSCs）能夠分泌炎癥標(biāo)志物和趨化因子， 包括RANTES、eotaxin、IFNγ、誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）、IL-6、IL-8 和白細胞介素受體拮抗劑蛋白（IL-1ra）［21］。通過上述研究得出結(jié)論，PDLSCs 是將免疫細胞募集到受感染組織的關(guān)鍵因素， 而未受刺激的MSCs 分泌的趨化因子水平可忽略。MSCs 暴露于鼠傷寒沙門菌和嗜酸乳桿菌也可導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)基因COX2、IL-6和IL-8 轉(zhuǎn)錄水平提高以及PGE2分泌增加。 除了表達AMPs，研究人員還發(fā)現(xiàn)感染細菌后，MSCs 中的免疫調(diào)節(jié)基因MCP-1、IL-6、IL-8 和CCL5 表達上調(diào)， 表明免疫細胞募集和激活是MSCs 殺滅微生物的機制。 研究進一步發(fā)現(xiàn)，MSCs 在暴露于米諾環(huán)素后，其免疫調(diào)節(jié)活性增加。米諾環(huán)素能誘導(dǎo)人源MSCs 中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的磷酸化，導(dǎo)致LL-37 含量減少、IL-6 含量增加、 金黃色葡萄球菌負荷總體凈減少。

3 抗菌藥物對MSCs 功能的影響

3.1 抗菌藥物對MSCs 具有抑制作用

抗菌藥物不僅在臨床醫(yī)學(xué)中用于治療細菌感染性疾病， 還用于預(yù)防細胞培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的微生物污染。 抗菌藥物可以在培養(yǎng)過程中對MSCs 產(chǎn)生影響， 甚至在使用抗菌藥物治療后對局部組織細胞也有影響。因此，MSCs 對細菌感染性疾病的治療效果可能會受到一些抗菌藥物的影響。研究發(fā)現(xiàn)， 不同類別的抗菌藥物對不同來源的MSCs有顯著影響?？蒲腥藛T對氨基糖苷類藥物是否對干細胞的生長具有負面作用進行了研究。當(dāng)以劑量依賴性方式與慶大霉素一起培養(yǎng)時，人源MSCs 的成骨和軟骨形成顯著減少；當(dāng)藥物濃度大于2 000 μg/mL 時， 在被其他氨基糖苷類藥物處理的成骨細胞中也觀察到了這一點， 例如妥布霉素和阿米卡星。在馬源MSCs 中，慶大霉素對體外細胞活力沒有影響，但在較高濃度（500 μg/mL）時降低了總RNA 水平，即蛋白質(zhì)表達受到了不同程度的抑制。在同一研究中，氟喹諾酮類藥物（如恩諾沙星）也導(dǎo)致MSCs活力和總RNA 水平顯著降低。 兩性霉素等抗生素會在培養(yǎng)24 h 內(nèi)影響MSCs 的生長和分化［22］，在使用氯霉素時也觀察到了這種情況。

3.2 抗菌藥物對MSCs 具有促分化作用

盡管許多抗菌藥物對MSCs 具有抑制作用，但也有一些抗菌藥物可以增強MSCs 分化。 四環(huán)素類藥物， 如強力霉素， 被證明可以增強人源MSCs 的軟骨形成和分化，這在體內(nèi)研究中得到了進一步證實。此外，土霉素可促進前軟骨細胞系中的軟骨分化，以劑量依賴性方式促進軟骨形成。桿菌肽等多肽類抗生素以劑量依賴性方式增強人源MSCs 的成骨分化， 并上調(diào)成骨基因表達水平［23］。與對照和經(jīng)青霉素—鏈霉素處理的MSCs 相比，經(jīng)兩性霉素B（AmB）和AmB-Cu 處理的MSCs 在存在成骨誘導(dǎo)因子（包括地塞米松、β-甘油磷酸和抗壞血酸）的情況下成骨。

3.3 抗菌藥物對MSCs 免疫調(diào)節(jié)作用的影響

抗菌藥物也被證明有可能誘導(dǎo)MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用。 在經(jīng)米諾環(huán)素處理的人源MSCs 中觀察到了這一點，這種效應(yīng)在后期開展的一項體內(nèi)研究中也得到證實。 在大鼠傷口模型中，與單獨使用水凝膠相比，載有米諾環(huán)素的水凝膠增強了培養(yǎng)體系中人源MSCs 的傷口愈合表型。 500 μg/mL 以上的頭孢噻呋等頭孢菌素類抗菌藥物會導(dǎo)致MSCs 的總RNA 減少，提示毒性作用。 在同一項研究中，不同濃度的青霉素總體上對MSCs 沒有顯著影響。

青霉素—鏈霉素的組合經(jīng)常用于細胞培養(yǎng)以避免污染，包括旨在研究MSCs 抗菌作用的試驗。盡管假設(shè)二者對細胞的影響可以忽略不計， 但已證明青霉素—鏈霉素會導(dǎo)致細胞基因表達、 細胞調(diào)節(jié)和細胞生長速率發(fā)生顯著變化。 這種影響可以直接干擾細胞對體外不同刺激的反應(yīng)， 從而影響試驗結(jié)果［24］。

4 小結(jié)與展望

在原理驗證研究和小型臨床案例研究中，MSCs 在治療感染性疾病方面顯示出一定的潛在功效，因此，有必要進一步挖掘利用MSCs 替代或改善當(dāng)前抗菌藥物療法的潛力。MSCs 通過多種機制發(fā)揮抗菌作用，包括分泌AMPs、提升宿主免疫系統(tǒng)功能和促進免疫細胞直接吞噬作用。MSCs 可以成為一種臨床上重要的廣譜抗菌劑， 能夠單獨有效地控制多重耐藥（MDR）菌株引起的感染，或者更有可能與常規(guī)抗菌藥物聯(lián)合使用。MSCs 有可能減少動物抗菌藥物的使用量并降低動物源細菌耐藥性的產(chǎn)生和擴散，這對人類健康也很重要。由于獸醫(yī)領(lǐng)域關(guān)于MSCs 的研究才剛剛出現(xiàn)， 還有許多研究問題需要解決。