曲小姝，石 丹，趙 娜，于曉洋，楊艷艷，劉 巖

(吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

多金屬氧酸鹽(Polyoxometalates，POMs)，簡稱多酸，是由高價態(tài)的前過渡金屬通過氧原子橋連結合而成的金屬氧簇[1].幾十年來，隨著世界各國對多酸藥理活性和結構修飾的研究不斷深入，多酸藥物化學蓬勃發(fā)展，其中最引人注目的是多酸抗腫瘤藥物的研究.多酸抗癌譜廣、抗腫瘤活性強、化合物本身毒性低，在抗腫瘤藥物領域有極高應用價值[2-5].仲鎢酸鹽-B是一種經典的同多酸，結構式為[H2W12O42]10-，其具有良好的抗艾滋病毒活性[6-8].我們報道了一種新型仲鎢酸鹽-B化合物[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O，研究發(fā)現，經過過渡金屬Cu修飾后的仲鎢酸鹽藥理活性顯著增強[9-10]，這說明化合物中Cu和W12簇為雙活性抗腫瘤中心.文獻記載很多金屬配合物具有生物活性，如過渡金屬鋅配合物在抗腫瘤研究方面受到廣泛關注[11-13].本文采用常規(guī)水溶液合成方法，以仲鎢酸鹽-B為基本建筑單元，利用過渡金屬鋅作為連接子，構筑基于仲鎢酸鹽-B的雙活性中心新化合物 (H3O)6[Zn(H2O)6]6{Zn6(C5H11NO)6(H2O)6[H2W12O42]3}·4H2O (簡寫為ZnW12)，選擇HeLa、HepG2、SHY5Y、SKOV-3 4種腫瘤細胞對其體外抗腫瘤活性進行了研究.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Bruker Smart CCD Apex(Ⅱ)型單晶衍射儀；AlpHa Centaurt FT/IR型紅外光譜分析儀；美國TA Q600同步熱分析儀；日本Olympus倒置相差顯微鏡；BIORAD公司680型酶標儀.

試劑：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT) 購自美國sigma公司；胎牛血清(Fetal bovine Serum)、RPMI 1640 (pH在7.0～7.2之間)、胰蛋白酶(trypsin)均購自Gibco公司；雙抗(青霉素鈉、硫酸鏈霉素)購自西安制藥公司；其他化學試劑均為分析純.HeLa、HepG2、SHY5Y和SKOV-3細胞株為吉林醫(yī)藥學院科學實驗室保存并提供.

1.2 化合物的制備

稱取Na2WO4·2H2O (2.30 g，6.96 mmol) 溶于100 mL水中，用稀H2SO4調pH值至4.16.稱取Zn(NO3)2·6H2O (2.56 g，8.61 mmol) 溶于50 mL水中，將鎢酸鈉溶液與硝酸鋅溶液緩慢混合，用甲基嗎啉溶液 (酸化到pH等于4.22) 和HOAc-NaAc溶液 (pH為 4.36) 調節(jié)pH至3.4左右，常溫攪拌20 min，冷卻至室溫，靜置，20 d后出現無色塊狀晶體.

1.3 X-射線單晶衍射測試

選取大小為0.279×0.181×0.183 mm3的單晶，采用Mo-Kα(λ=0.071 073 nm)為輻射源，室溫296 K下，用Bruker Smart CCD Apex(Ⅱ)衍射儀，掃描范圍1.65°<θ<25°.應用經驗吸收校正.共收集29 071個衍射數據(獨立衍射點6 916，Rint=0.054 6[I>2σ(I)，hkl值范圍：-29≤h≤30，-30≤k≤19，-37≤l≤36].晶體結構用直接法解出，對全部非氫原子及其各向異性熱參數進行全矩陣最小二乘法修正，氫原子坐標采用理論加氫方法得到，最終偏離因子R1=0.028 0，wR2=0.072 3[I>2σ(I)；R1=0.035 3，wR2=0.074 8 (all data).結構分析表明，該晶體屬于三方晶系，空間群R-3m：H，a=2.443 48 (7) nm，b=2.443 48 (7) nm，c=3.045 86 (19) nm，α=90 (3)°，β=90 (3)°，γ=120 (2)°，V=15.749 2 (13) nm3，Z=3.結構簡式為C30H66N6O190W42Zn6，相對分子質量為11 664.81.所有計算均使用SHELXTL-2018/3 (Sheldrick，2018) 程序完成.

1.4 MTT法測腫瘤細胞活力

把對數生長期的HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y細胞調成密度為1×105個/mL，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μL密度為1×105個/mL的腫瘤細胞懸液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h后把腫瘤細胞分成空白對照組及6組實驗組(濃度為0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的藥物)，用DMEM培養(yǎng)基稀釋液分別培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結束，每孔加入新鮮配制的MTT溶液20 μL并再孵育4 h，當在倒置顯微鏡下看到孔板內的細胞周圍出現絲狀紫色結晶體時倒掉上清液，每孔加DMSO150 μL振蕩溶解細胞并用平板搖床搖勻，在波長570 nm使用酶標儀測定光密度值(OD).按以下公式計算增殖抑制率：增殖抑制率=[1-藥物試驗組吸光度值/對照組吸光度值]×100%.重復試驗 3次，取平均值.

1.5 細胞凋亡的形態(tài)學觀察

取對數生長期的HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y細胞，培養(yǎng)24 h后，去上清液，將細胞分成正常對照組以及濃度為0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的ZnW121—6組，4種腫瘤細胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)24 h后，與正常對照組一起于倒置顯微鏡下觀察不同濃度藥物對腫瘤細胞的影響，從生長抑制、細胞形態(tài)角度進行評估.

2 結果與討論

2.1 晶體結構

X-射線晶體學研究表明，ZnW12中仲鎢酸鹽陰離子[H2W12O42]10-通過Zn八面體連接成了二維結構，游離態(tài)的配陽離子[Zn(H2O)6]2+和結晶水存在于晶格之間.如圖1所示，在[H2W12O42]10-陰離子中，W—O鍵可分為3種類型：(1)端氧W—O(t)鍵長范圍為0.171 3(10)～0.242 7(7) nm；(2)橋氧W—O(μ)鍵長范圍為0.176 8(7)～0.215 7(6) nm；(3)鍵連到3個鎢原子上的橋氧W—O鍵長范圍為0.228 1(9)～0.222 8(6) nm.化合物中Zn原子呈6配位八面體構型，分別和4個來自[H2W12O42]10-的O，1個配位水上的O以及1個甲基嗎啉分子上的O配位.如圖2所示，從c軸方向看，3個W12簇通過Zn八面體連接而成一個三角形的小環(huán)，小環(huán)之間又通過Zn八面體的連接以及W12簇的共用連接形成了二維層結構.二維層結構中含有由12個W—O八面體連接而成的大環(huán)，形成了圓形的孔洞，其間容納著6個椅式構象的甲基嗎啉分子.值得一提的是，結構中還存在另一種Zn2+原子，與6個配位水配位形成了八面體構型，孤立存在于鎢簇構成的二維層間.二維層之間是孤立的，在三維空間錯位排列，從c軸方向觀察化合物具有孔洞，其間容納著游離水.

圖1 Zn修飾的[H2W12O42]10-陰離子球棍圖

綠色：鎢氧八面體；紫色：鋅氧八面體

2.2 紅外光譜

圖3 ZnW12的紅外光譜

2.3 熱重分析

合成化合物的熱重分析如圖4所示，在TG曲線中，化合物共有3步連續(xù)失重：47 ℃～118 ℃，118 ℃～148 ℃和148 ℃～447 ℃，分別對應于結晶水、配位水和有機物甲基嗎啉的失去.達到665 ℃后，多酸骨架開始坍塌，最后炙灼殘渣為W和Zn的氧化物.實際失重量為15.44%，與理論計算值15.07%基本一致，說明熱重分析與晶體結構表征吻合.

圖4 ZnW12的TG曲線

2.4 MTT法測腫瘤細胞活力

采用MTT法評估了ZnW12對HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y腫瘤細胞株增殖的影響(見表1).與對照組比較，不同濃度的ZnW12對腫瘤細胞的抑制率增大，表明ZnW12對4種腫瘤細胞均有抑制作用，且隨著濃度的增加細胞的存活率下降，具有藥物劑量依賴性，與母體酸Na10(H2W12O42)·26H2O (簡寫為NaW12) 相比[10]，經過渡金屬鋅修飾的仲鎢酸鹽抗腫瘤活性顯著增強.

表1 不同濃度NaW12和ZnW12處理腫瘤細胞的抑制率和IC50

2.5 細胞凋亡的形態(tài)學觀察

分別用濃度1，10，20，50及100 μmol/L的ZnW12處理腫瘤24 h后，觀察細胞形態(tài).圖5顯示正常對照組的腫瘤細胞緊貼瓶底，細胞密集，細胞間連接緊密，呈有規(guī)則的多邊形，細胞觸角較短，圓形細胞較少.ZnW12處理后，細胞較為稀疏，附壁疏松，脫壁，細胞變圓變亮.

a—d：對照組；e：50 μmol/L ZnW12處理的HeLa；f：20 μmol/L ZnW12處理的SKOV-3；g：50 μmol/L ZnW12處理的HepG2；h：20 μmol/L ZnW12處理的SHY5Y

3 結論

本文基于分子設計的思想，利用常規(guī)水溶液合成方法，合成了一種由過渡金屬鋅修飾的新型仲鎢酸鹽.通過X-射線單晶衍射、紅外光譜和熱重分析對化合物結構進行了表征，同時對其體外抗腫瘤性質進行了初步研究.MTT細胞活性檢測說明，ZnW12對HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y腫瘤細胞增殖均有抑制作用，IC50遠遠小于未經鋅修飾的母體多酸，這表明過渡金屬鋅修飾的仲鎢酸鹽具有雙活性抗腫瘤中心，藥理活性顯著增強.