吳 慧，陳保冬，朱永官，岳獻榮，張乃明,4，夏運生,2,4

（1.云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 云南 昆明 650201；2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085；3.中國科學院大學, 北京 100049；4.云南省土壤培肥與污染修復工程實驗室, 云南 昆明 650201）

我國擁有豐富的礦石資源，大規(guī)模的工業(yè)采礦活動帶來巨大經(jīng)濟利益的同時，不可避免地產(chǎn)生了大量礦業(yè)廢棄物，其中尾礦產(chǎn)生量占加工礦石總量的97%～99%[1]，一般未經(jīng)任何處理存放在露天礦山中，是陸地生態(tài)系統(tǒng)的主要污染物之一，在各類公害中排名第18 位[2]。作為世界上第二大鐵尾礦生產(chǎn)國家，2015 年我國尾礦產(chǎn)量約60.7 億t[3]。有“十里鐵山”之稱的大孤山鐵礦是我國最大的露天鐵礦，經(jīng)近百年的開采加工，尾礦堆存量巨大。閑置的鐵尾礦不僅占用大量土地資源，覆蓋原有植被，嚴重影響周圍土壤中的生物群落，而且對尾礦周邊的土壤、水體及空氣造成嚴重污染，對人類健康產(chǎn)生嚴重威脅[4-5]。

目前，尾礦治理中常用的修復方法有物理修復、化學修復和生物修復。植物修復是一種高效、廉價、環(huán)境友好型生物修復技術，被認為是尾礦治理的最佳方式之一[6]。鐵尾礦理化性質(zhì)差，生境破壞嚴重，是植被重建的困難立地類型之一[7]。因此，尋找一種既能增強植物定植的能力又能提高尾礦植被多樣性的模式已經(jīng)成為研究熱點之一。鐵尾礦營養(yǎng)匱乏，具有固氮能力的豆科植物可優(yōu)先選擇。豆科/禾本科混種，豆科植物對禾本科植物養(yǎng)分吸收和生長具有促進作用[8]。在自然條件下，叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)能與80%的植物根系建立共生關系，形成叢枝菌根結構[9]。AMF一方面能增強植物對礦質(zhì)元素的吸收，促進植物生長，提高植物抗逆能力[10-11]；另一方面，在間作水平上，能調(diào)節(jié)植物間競爭作用[12]。鐵尾礦因具有礦質(zhì)養(yǎng)分含量低、物理結構差等不利因素，植物很難在尾礦砂中存活，但接種AMF 能提高植物的存活率，促進植株在復合逆境中的定植，AMF 在尾礦多樣性植被恢復中的積極作用不容忽視[13-14]。

為此，采用單子葉黑麥草(Lolium perenne)和雙子葉白三葉(Trifolium repens)兩種先鋒植物，比較單獨和混合種植模式下接種摩西球囊霉(Funneliformis mosseae)對植株生長參數(shù)、礦質(zhì)元素吸收及種間競爭的影響，研究叢枝菌根真菌對植物適應鐵尾礦的積極貢獻，探討菌根技術在鐵尾礦區(qū)多樣性先鋒植物重建中的作用。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基質(zhì)

試驗所用鐵尾礦砂采自遼寧省鞍山市大孤山鐵礦(41°02′42″～41°03′37″ N， 123°02′55″～123°04′08″ E)。尾礦砂pH 為8.26，有機質(zhì)、全磷(P)及 水 溶 性P 含 量 分 別 為2.89 g·kg-1、92.7 mg·g-1和0.79 mg·kg-1，陽離子交換量為1.58 mol·kg-1，全量鐵(Fe)、錳(Mn)、銅(Cu)和鋅(Zn)含量分別為118 322、428、5.74 和27.9 mg·kg-1，DTPA 可提取態(tài)Fe、Mn、Cu 和Zn 含量分別為41.0、5.24、0.38 和0.30 mg·kg-1。尾礦砂過2 mm 篩，高壓蒸汽120 ℃滅菌2 h，殺滅土著菌根真菌。

1.2 供試植物和菌根真菌

供試植物為白三葉和黑麥草，播種前用10%H2O2對種子進行表面消毒10 min ，蒸餾水沖洗多次后白三葉催芽一晝夜、黑麥草催芽三晝夜，出芽后播種。

供試叢枝菌根真菌摩西球囊霉在“中國叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫”編號為BGC XJ03A，由北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所王幼珊研究員提供，分離自新疆阿克蘇水稻根際，用高粱(Sorghum bicolor)擴繁，每10 g 菌劑摩西球囊霉為120 個孢子。

1.3 試驗設置

兩種植物單獨種植[單種白三葉(W)、單種黑麥草(R)]或混合種植[白三葉和黑麥草混種(混合種模式下的白三葉(W/R)、混合種模式下的黑麥草(R/W )]，對不同種植模式均設置不接種(NM)和接種摩西球囊霉 (FM)共6 個處理，每個處理重復4 次。為了保證控制試驗各處理水分和養(yǎng)分條件的統(tǒng)一和一致性，以內(nèi)襯一個塑料袋的白色塑料花盆為種植容器，每盆裝1 kg 滅菌的尾礦砂和基礎養(yǎng)分，混勻后平衡兩周。接種處理添加50 g 菌劑，對照處理添加50 g 滅菌菌劑。試驗前基底內(nèi)加基肥氮60 mg·kg-1，后期追施氮30 mg·kg-1，磷30 mg·kg-1，鉀67 mg·kg-1，微量元素按常量施用，肥料配置成Hoagland’s 營養(yǎng)液添加。

該盆栽試驗研究在中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心溫室中完成，溫度控制在20～25 ℃，自然采光，在植株的整個生長過程中采用稱重法，保持盆栽含水量為田間持水量的60%～70%。白三葉單獨種植每盆播32 顆種子，黑麥草單獨種植每盆播28 顆種子，混合種植處理，白三葉播種16 顆，黑麥草播種14 顆，均勻播種于容器中。播種前一天澆水130 mL，播種白三葉時對土壤表面進行松翻，播種黑麥草時在土壤表面開溝，播入種子后，覆土澆水。牛皮紙遮蓋待植物出土，出苗后單種白三葉間苗至16 株，單種黑麥草間苗至14 株；混種模式下白三葉間苗至8 株，混種模式下黑麥草間苗至7 株。

1.4 植株樣品采集和測量

收獲時齊地面將植株地上部剪下(混種處理分別收獲)，用去離子水洗凈、烘干、稱重。從礦砂中清洗出根系(混種處理分別收獲)，稱鮮重后取約0.5 g(鮮重)用于測菌根侵染率，其余烘干稱重。

植物樣品烘干后剪碎稱取約0.3 g 左右樣品，用HNO3、HClO4混合酸消煮制備待測溶液。用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀 (ⅠCP-OES, Optima 2000DV,Perkin Elmer Co.USA) 測定Fe、Mn、Cu、Zn、P 礦質(zhì)元素的濃度。用曲利苯藍染色-直線截獲法測定菌根侵染率[15-16]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根冠比(root to shoot ratio, RSR) = 地下生物量/地上生物量；鐵吸收效率 = 植株鐵吸收量/根系生物量。

土地當量比[17](land equivalent ratio, LER) = (混種系統(tǒng)白三葉產(chǎn)量/單作系統(tǒng)白三葉產(chǎn)量) + (混種系統(tǒng)黑麥草產(chǎn)量/單作系統(tǒng)黑麥草產(chǎn)量)。LER ＞ 1，表明具有產(chǎn)量優(yōu)勢，反之有劣勢。

種間相對競爭能力[18](aggressivity, A) = (混種系統(tǒng)黑麥草產(chǎn)量/單種系統(tǒng)黑麥草產(chǎn)量)－(混種系統(tǒng)白三葉產(chǎn)量/單種系統(tǒng)白三葉產(chǎn)量)。A ＞ 0 表示黑麥草競爭能力強于白三葉；A ＜ 0 表示白三葉競爭能力強于黑麥草。

采用Excel 2000 統(tǒng)計及做圖，采用SPSS 軟件對種植模式和菌根處理進行雙因素方差分析，在兩者交互作用顯著的情況下，對所有處理進行LSD 多重比較，檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 菌根侵染率和根冠比

方差分析表明(表1)，不同種植模式、不同菌根處理及二者互作極顯著影響著植物根系的菌根侵染率(P＜ 0.001)；不同菌根處理和菌根與種植模式的交互作用極顯著影響著植株根冠比(P＜ 0.001)，不同種植模式顯著影響植株根冠比(P＜ 0.05)。

表1 不同種植模式和菌根處理下菌根侵染率和根冠比Table 1 Mycorrhizal infection rate and root-shoot ratio under different planting modes and mycorrhizal treatments

對照(NM)植株根系未觀察到AMF 侵染現(xiàn)象。接種FM，無論單獨種植還是混合種植，白三葉根系均具有較高的菌根侵染率，在45%左右；黑麥草單獨種植或混合種植的根系菌根侵染率都較低，在22%左右。FM 處理顯著降低了白三葉根冠比(P＜ 0.05)；混合種植顯著增加了黑麥草根冠比。

2.2 植物生長狀況

方差分析表明，不同種植模式和不同菌根處理間的交互作用極顯著影響白三葉和黑麥草地上部干重(P＜ 0.001)，不同菌根處理顯著影響黑麥草單種地上部干重(P＜ 0.01)；不同種植模式極顯著影響植物地下部干重(P＜ 0.001)，二者交互作用顯著影響植物地下部干重(P＜ 0.05)。

白三葉生物量混合種植處理下低于單獨種植，而黑麥草趨勢與之相反(圖1)。單獨種植或混合種植情況下，接種FM 均顯著提高白三葉的地上部和根系生物量(P＜ 0.05)，促進其生長，接種 FM 顯著降低混種模式下黑麥草地上部生物量，對黑麥草地下部生物量影響不明顯，混合種植顯著增加了黑麥草生物量。接種FM 顯著降低了混種模式下白三葉生物量?；旌戏N植NM 處理下白三葉生物量最低。

圖1 不同種植模式和接種處理下單株植物地上部和根系生物量干重Figure 1 Dry weight of shoot and root of each plant under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.3 植株鐵含量

方差分析表明，不同植物種植模式、不同菌根處理及其二者交互作用均極顯著影響植株地上部及根系鐵含量(P＜ 0.001)。

綜合來說(圖2)，黑麥草混合種植處理植株體內(nèi)鐵含量在各處理中最高，接種FM 顯著 降低除單種黑麥草外植物地上部鐵含量(P＜ 0.05)，白三葉混種FM 處理降低最明顯，降低了55.2%。單種模式下，接種FM 對兩種植物根系鐵含量沒有顯著影響；混合種植模式下，F(xiàn)M 處理顯著增加白三葉根系鐵含量(P＜ 0.05)，增加了71.3%，而對黑麥草影響趨勢相反。

圖2 不同種植模式和接種處理下植物地上部和根系鐵含量Figure 2 Iron concentration in plant shoot and root under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.4 植株鐵吸收量

方差分析表明，不同種植模式以及種植模式和菌根處理的交互作用極顯著影響植物地上部鐵吸收量(P＜ 0.001)，不同菌根處理顯著影響地上部鐵吸收量(P＜ 0.05)；不同種植模式、不同菌根處理以及二者交互作用均極顯著影響根系鐵吸收量(P＜ 0.001)。

黑麥草單獨種植或混合種植，每株對鐵的吸收量遠高于單獨種植白三葉(P＜ 0.05)。 接種FM 顯著降低了混種模式下黑麥草對鐵的吸收量 (P＜ 0.05)，降低了 44.3%～45.51%，增加了白三葉和單種模式下黑麥草鐵吸收量。較單種，混種顯著增加了黑麥草鐵吸收量，但對白三葉沒有明顯影響(圖3)。

圖3 不同種植模式和接種處理下單株植物地上部和根系鐵吸收量Figure 3 Iron uptake by plant shoots and roots under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.5 根系鐵吸收效率

方差分析顯示，不同種植模式以及種植模式與菌根處理交互作用極顯著影響植物根系鐵吸收效率(P＜ 0.001)，不同菌根處理顯著影響植物根系鐵吸收效率(P＜ 0.05)。

混合種植情況下，白三葉和黑麥草對鐵的吸收效率均顯著增加(P＜ 0.05) (圖4)。單獨種植條件下，接種FM 與未接種之間差異不顯著(P＞ 0.05)，混合種植情況下，接種FM 能顯著增加白三葉對鐵的吸收效率(P＜ 0.05)，增加了63.5%，顯著降低黑麥草對鐵的吸收效率(P＜ 0.05)，降低了42.5%。

圖4 不同種植模式和接種處理下植物根系的鐵吸收效率Figure 4 Iron uptake efficiency of plant roots under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.6 植株磷、鋅、銅、錳含量

方差分析表明(表2)，植株磷、錳含量在不同種植模式、不同菌根處理內(nèi)差異極顯著(P＜ 0.001)，且兩者具有極顯著交互作用(P＜ 0.001)；銅含量在不同種植模式和不同菌根處理間的交互作用極顯著(P＜ 0.001)；鋅含量在不同菌根處理和不同種植模式間的交互作用顯著(P＜ 0.05)，不同種植模式內(nèi)差異極顯著(P＜ 0.001)。

總的來說，白三葉鋅含量除NM-單種處理外均顯著高于黑麥草(P＜ 0.05)。無論單獨或混合種植，NM 處理下白三葉磷含量顯著低于黑麥草，接種后反而顯著高于黑麥草。接種FM 顯著增加了白三葉磷和銅含量，磷含量增加168%～357%，顯著降低了單種黑麥草銅、鋅含量。接種FM 顯著降低了兩種植株體內(nèi)的錳含量(表2)。

表2 不同種植模式和菌根處理下植株礦質(zhì)元素含量Table 2 P, Zn, Cu, and Mn concentrations in plants under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.7 根際pH 變化

方差分析顯示，不同菌根處理以及菌根與種植模式的交互作用極顯著影響根際pH (P＜ 0.001)，不同種植模式對根際pH 無顯著影響(P＜ 0.05)。

單獨種植黑麥草NM 處理的鐵尾礦砂pH 低于其他處理，接種FM 對基質(zhì)pH 影響明顯。單種模式下，接種FM 顯著降低了白三葉根際的pH (P＜0.05)，顯著增加了黑麥草根際pH (P＜ 0.05)?；旆N模式下，接種FM 顯著增加了黑麥草根際的pH (P＜0.05) (表3)。

表3 收獲時不同種植模式和菌根處理下鐵尾礦砂pHTable 3 pH of iron mine tailings from different plant mode and mycorrhizal treatments at harvest

2.8 植物生產(chǎn)力和種間競爭能力

與未接種相比，接種處理降低了白三葉與黑麥草混種模式的當量比，減少了約20.8%，并減弱了兩種植物的種間競爭能力。混種模式下，當量比都大于1 (表4)。種間競爭能力結果是相對于白三葉而言，無論接種與否，種間競爭能力都大于0，接種處理使黑麥草競爭能力呈下降趨勢，提高了白三葉的競爭能力。

表4 白三葉和黑麥草混種系統(tǒng)的當量比和競爭能力Table 4 Aggressivity of mixed planting system of white clover and ryegrass

3 討論

3.1 AMF 及種植模式對白三葉和黑麥草礦質(zhì)營養(yǎng)和生長的影響

AMF 能通過改善植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收增強植物對逆境的適應能力，在菌根共生系統(tǒng)中，植物為菌根真菌提供光合產(chǎn)物，而菌根真菌通過其龐大的根外菌絲網(wǎng)絡促進植物對水分和礦物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收(主要為磷、鋅等元素)[19-20]。Segnitz 等[21]研究指出，叢枝菌根真菌侵染植株根系能夠顯著提高植物對土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及生長。肖毅雪等[22]試驗表明，在銅尾礦中，單獨種植或混合種植條件下，接種菌根真菌均能顯著提高白三葉對磷的吸收，促進白三葉的生長。本研究結果與其一致(圖1、表2)。鐵尾礦中，無論單獨種植還是與黑麥草混合種植，接種FM 顯著促進白三葉對磷、銅等礦質(zhì)元素的吸收，顯著增加白三葉的干重，促進白三葉生長。

豆科/禾本科混種，豆科植物生物固氮能夠促進禾本科植物生長。有研究指出，蠶豆(Vicia faba)進入玉米(Zea mays)根區(qū)的根系很少，但玉米根系能進入蠶豆根區(qū)，吸收更多的養(yǎng)分，促進自身生長[23]。張德等[8]發(fā)現(xiàn)，柱花草(Stybsanthes guianensis) || 扭黃茅(Heteropogon contortus) || 孔穎草(Bothriochloa pertusa)間作體系的土地當量比均大于1，具有間種優(yōu)勢。本研究結果得出混種系統(tǒng)土地當量比大于1，白三葉與黑麥草混種具間作優(yōu)勢。

種植白三葉顯著降低了鐵尾礦砂pH，有利于活化礦質(zhì)元素，但同時可能增加金屬元素的富集，影響植物生長。菌根真菌在一定程度上可以減少重金屬對植物的毒害。Tang 等[24]研究表明，在低濃度重金屬脅迫下，接種菌根真菌并不抑制寄主植物對重金屬的吸收，而是將重金屬輸送到植物根際，使其被大型菌絲吸收到植物的根和地上部中，通過促進宿主植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運輸，促進植物生長，稀釋重金屬濃度來減輕重金屬對宿主植物的毒害。Liu 等[25]指出，菌根真菌能通過促進植物光合作用和營養(yǎng)元素吸收，增加植物生物量，從而稀釋植物中重金屬的濃度，降低重金屬的毒性。本研究中，單獨種植或混合種植模式下接種FM，白三葉對鐵元素的吸收均呈增加趨勢，F(xiàn)M 處理顯著增加白三葉生物量，顯著降低白三葉鐵含量；黑麥草單獨種植，F(xiàn)M 處理顯著增加黑麥草對鐵的累積量，但混合種植情況下卻顯著降低了鐵的吸收量；接種菌根真菌，白三葉地上部鐵含量顯著降低，根部鐵含量顯著增加。

3.2 AMF 對種間競爭的影響

大量研究證實，AMF 不但能改善植株個體本身營養(yǎng)狀況[26]，且能改善種間競爭關系[27]。趙乾旭等[28]研究指出，玉米 || 大豆間作系統(tǒng)中，玉米相對大豆一直表現(xiàn)出競爭優(yōu)勢，接種菌根真菌，調(diào)整了營養(yǎng)分配，改善了兩者間的競爭。張宇亭等[29]指出，接種能提高菌根植物的競爭能力，提高競爭優(yōu)勢，這對土地資源利用與植被多樣性具有十分重要的意義。本研究結果顯示，相對于白三葉，黑麥草競爭能力大于0，表現(xiàn)出競爭優(yōu)勢，但接種處理白三葉菌根侵染率顯著高于黑麥草，使黑麥草競爭優(yōu)勢降低而提高白三葉的競爭能力。

可見，接種叢植菌根真菌對黑麥草生長和元素吸收影響沒有白三葉明顯，可能與黑麥草本身抗逆性強、對菌根真菌的依賴性低有關。該研究中更有價值的結果是兩種植物混合種植情況下接種菌根真菌能提高白三葉的競爭力，這對于強化鐵尾礦上草本先鋒植物的生長有非常重要的意義。

4 結論

通過在鐵尾礦砂上種植白三葉和黑麥草并接種叢枝菌根真菌，結果表明，白三葉對菌根真菌的依賴性更強。接種叢枝菌根真菌能顯著提高白三葉對磷的吸收并促進植物生長?；旌戏N植則顯著促進了黑麥草生長。菌根真菌在白三葉與黑麥草的種間競爭中，對增強白三葉競爭能力有積極作用。利用叢枝菌根真菌與白三葉、黑麥草的多樣性共生關系對強化鐵尾礦的生態(tài)恢復具有良好的應用前景。