凌忠滿 羅維貴

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的慢性氣道疾病，嚴重危害人類的健康安全和影響生命質(zhì)量，是導致死亡的重要原因，并給患者以及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。2018 年調(diào)查顯示，我國20 歲及以上成人COPD 患病率約為8.6%，40 歲及以上人群患病率高達13.7%，由此估算我國患COPD 總?cè)藬?shù)近1 億[1]。隨著愈發(fā)嚴峻的環(huán)境空氣污染、吸煙率高和人口老齡化等因素，COPD 的發(fā)病率逐年上升，成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。世界衛(wèi)生組織（WHO）對全球健康評估報告顯示，截至2019 年COPD 已成為世界第三大死亡原因[2]。根據(jù)全球疾病負擔（GBD）數(shù)據(jù)研究結(jié)果顯示，COPD 患病率預計在未來25 年時間將持續(xù)升高[3]，持續(xù)成為世界性公共衛(wèi)生問題。

COPD 的發(fā)病機制復雜，目前認為COPD 發(fā)病機制有氣道氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等，與多種因素密切相關(guān)，如吸煙、空氣污染、職業(yè)粉塵和化學物質(zhì)、感染因素、免疫應(yīng)答、年齡、氣道高反應(yīng)、自主神經(jīng)功能失調(diào)等，其中吸煙為最主要的危險因素。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一類多功能且高度保守的應(yīng)激反應(yīng)蛋白[4]，而熱休克蛋白70（heat shock proteins70，Hsp70）是HSPs 中最為保守、最為重要的一員，在高溫、缺氧、缺血、感染、吸煙、免疫反應(yīng)等應(yīng)激狀態(tài)下可被誘導提高表達水平，起到保護細胞的作用，被認為參與COPD 的發(fā)病機制而受到關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)Hsp70 可作為COPD 疾病診斷和判斷治療預后的生物指標。本文對Hsp70 在COPD 的相關(guān)研究進展予以綜述，旨在為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 Hsp70的概述

1.1 Hsp70 的結(jié)構(gòu) 據(jù)報道，在人類中的Hsp70 家族有多達13 個成員，雖其在細胞內(nèi)外的場所有所不同，但均有共同的域結(jié)構(gòu)[5]。Hsp70 由一個保守的含有三磷酸腺苷（ATP）酶活性的氮末端核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）和一個不太保守的帶有底物結(jié)合位點的碳末端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SBD）組成，NBD 和SBD 則通過一個帶電和高度保守的接頭相連接[6-7]。NBD 分為兩個葉（Ⅰ和Ⅱ），進一步分為四個子域，即ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB。SBD 由包含底物結(jié)合裂縫的β 夾心結(jié)構(gòu)域（SBDβ）和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)（即底物）親和力的α 螺旋“蓋”結(jié)構(gòu)域（SBDα）組成，SBDα 作為SBDβ 的蓋子，促進底物的穩(wěn)定結(jié)合[8]。接頭作為負責NBD 和SBD 變構(gòu)的信息傳導控制元件，由7～13 個殘基組成，其主要表現(xiàn)為疏水性。由于接頭的核酸片段的長度較短，若其中核酸序列發(fā)生變異就會對其結(jié)構(gòu)、功能及NBD 和SBD 之間變構(gòu)調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要影響。因此，Hsp70 接頭調(diào)節(jié)Hsp70 的結(jié)構(gòu)功能特征，包括其整體構(gòu)象、對肽底物的親和力以及與共同伴侶的相互作用等[7]。

1.2 Hsp70 的分布及功能 Hsp70 是Hsp70 家族的誘導成員，在大多數(shù)無應(yīng)激狀態(tài)下的正常細胞和組織中以低水平或不可檢測的水平表達，但在各種應(yīng)激狀態(tài)下被快速誘導表達，主要分布在細胞核、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[9-10]。Hsp70 在細胞受到熱休克、感染、炎癥等因素刺激后被誘導表達升高，通常在細胞內(nèi)作為重要的分子伴侶，廣泛參與蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和質(zhì)量控制，監(jiān)督蛋白質(zhì)的運輸和跨膜轉(zhuǎn)運，降解修復錯誤折疊的蛋白質(zhì)，與共同伴侶協(xié)同作用維持蛋白質(zhì)組的穩(wěn)態(tài)[11]。Hsp70 除了抑制細胞凋亡、抗炎作用以外，還與腫瘤細胞增殖和遷移密切相關(guān)[12-13]。此外，Hsp70 在細胞受到損害應(yīng)激時表達升高，促進細胞修復和延長生命，其表達減少則促進細胞凋亡，因此被認為是細胞壽命的潛在生命標記物[14-15]。后來在一些正常和病理狀態(tài)下的個體的細胞外環(huán)境中發(fā)現(xiàn)Hsp70，細胞外Hsp70 才逐漸進入了人們的視野。最初認為細胞外Hsp70 來源于細胞內(nèi)，是由細胞裂解后被動釋放到細胞外[16]，后來相關(guān)研究表明細胞在應(yīng)激條件下可通過非經(jīng)典途徑主動分泌釋放[17-19]。細胞外Hsp70 在體液中以游離形式存在，在低水平時促進免疫反應(yīng)，發(fā)揮保護細胞功能，但一旦超過某一臨界閾值后則增強炎癥反應(yīng)[20]。

2 Hsp70與COPD的相關(guān)性

2.1 Hsp70 抗氧化應(yīng)激作用減輕COPD 肺細胞損傷 眾所周知，氧化應(yīng)激增加是COPD 發(fā)病的關(guān)鍵機制[21]。氧化應(yīng)激是機體或細胞內(nèi)氧化物質(zhì)產(chǎn)生或外源性氧化物質(zhì)攝入過多與清除失衡，引起機體或細胞內(nèi)促氧化因子蓄積的一種病理狀態(tài)，可導致線粒體脫氧核糖核酸（DNA）損傷和細胞損傷[22]。受到外源性因素刺激后，COPD 患者的呼出氣冷凝物、血清和體循環(huán)標本中氧化應(yīng)激標記物水平增加[23-24]。引起COPD 呼吸道氧化應(yīng)激的原因不僅包括吸入的香煙煙霧及其他刺激物，還包含被激活的炎癥反應(yīng)細胞[23-24]，其中香煙煙霧是最重要的致病因素[1]。香煙煙霧中含有種類繁多的氧化劑誘發(fā)氣道氧化應(yīng)激，促進COPD 的發(fā)展。氣管上皮細胞受到香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激后，Hsp70 表達水平上升增強細胞抗氧化應(yīng)激能力，抑制線粒體膜電位的丟失，減少中性粒細胞對氣道炎癥的反應(yīng)[25]。線粒體為調(diào)控細胞能量、氧化還原及信號傳導的重要細胞器，Hsp70 阻斷線粒體膜透化，有效抑制蛋白質(zhì)聚集及降解錯誤蛋白。細胞內(nèi)氧化還原敏感系統(tǒng)的NRF2/KEAP1 信號通路和抗氧化防御基因多態(tài)性與COPD 的發(fā)病機制存在密切關(guān)聯(lián)[26]。當細胞受到氧化應(yīng)激后，NRF2/KEAP1 復合物分解并誘導抗氧化防御基因的表達[27-29]。NRF2 作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控COPD 抗氧化基因的表達，KEAP1 作為銜接蛋白介導NRF2 調(diào)控作用[30]。動物實驗結(jié)果表明，CSE 和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合可誘導下調(diào)COPD 大鼠肺組織NRF2 蛋白的表達和NRF2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的抗氧化酶的表達，增加8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）表達水平[31]。另外，CSE 對人氣道平滑肌細胞的毒性作用顯著增加8-OHdG 水平、DNA 損傷和細胞凋亡，并且降低Hsp70 的生成，Hsp70 表達水平與8-OHdG、DNA 損傷和細胞凋亡呈負相關(guān)[32]。其中8-OHdG 是評價氧化應(yīng)激中DNA 氧化損傷的重要生命標記物。因此認為，Hsp70 可能參與COPD 的抗氧化基因的調(diào)控，通過NRF2/KEAP1 信號通路發(fā)揮抗氧化作用，參與了COPD 的發(fā)病機制，保護細胞抵抗CSE 的氧化應(yīng)激損傷，降低氣道細胞暴露在CSE 引起的相關(guān)氣道疾病，維持細胞正常功能，這對于減少氣道損傷阻斷COPD 疾病的發(fā)生與進展有重要作用。

2.2 Hsp70 參與COPD 的氣道和全身炎癥反應(yīng) COPD的本質(zhì)是炎癥性疾病，多種炎癥細胞參與COPD 的氣道炎癥，被激活的炎癥細胞釋放多種炎癥介質(zhì)作用于氣道上皮細胞，尤其是COPD 急性加重時炎癥細胞聚集、炎癥因子的大量釋放，誘導氣道上皮杯狀細胞化生和氣道黏液分泌增加，炎癥因子刺激氣道周圍平滑肌和成纖維細胞增生導致小氣道重塑，加重氣流受限程度。此外，COPD 存在全身系統(tǒng)性炎癥，即肺外炎癥，與疾病的進展和并發(fā)癥有關(guān)[33]。Hsp70 具有穩(wěn)定的抗炎作用，廣泛參與到COPD 發(fā)病的氣道炎癥反應(yīng)中，一方面作為伴侶蛋白發(fā)揮抗炎作用，另一方面又分泌到細胞外作為炎癥介質(zhì)激活先天免疫和炎癥反應(yīng)[20，34]。有研究分別將濃度為2.5%和15%的CSE 與重組人熱休克蛋白70（rhHsp70）組合處理作用于支氣管上皮NCI-H292 細胞觀察炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示2.5%CSE組合rhHsp70 減少了細胞因子的分泌，原因可能是rhHsp70 消除了2.5%的CSE 誘導TLR2 和TLR4 基因的表達，抑制白介素1α（IL-1α）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）等細胞因子的分泌，而15%的CSE 與rhHsp70 組合則顯示促炎作用，并且增加細胞內(nèi)Hsp70 mRNA 的表達，認為rhHsp70 通過MAPK 和NF-kB 信號通路調(diào)節(jié)CSE 對NCI-H292的炎癥反應(yīng)[35]。另外，在COPD 肺供體分離的原代支氣管上皮細胞中也證實了細胞外Hsp70 通過Toll 樣受體激活免疫細胞并誘導合成IL-6 和IL-8，增強了CSE 刺激炎癥反應(yīng)[35]。以上研究結(jié)論表明Hsp70 在參與COPD 炎癥反應(yīng)中似乎表現(xiàn)為“雙重作用”，即既在氣道炎癥反應(yīng)中主要表現(xiàn)為抗炎，而在細胞外則有抗炎和促炎作用。目前認為細胞外Hsp70 主要作用是促炎還是抗炎取決于細胞類型和炎癥環(huán)境以及細胞內(nèi)和細胞外Hsp70 的濃度比。但到目前為止，可以確定的是細胞外Hsp70 與香煙引起COPD 氣道炎癥有關(guān)，其表達水平可以反映全身炎癥應(yīng)激狀態(tài)，在一定程度上可以反映COPD 的嚴重程度[36]，但還沒有相關(guān)研究報道確定細胞外Hsp70 的具體濃度參數(shù)對決定其參與COPD 炎癥反應(yīng)的強度或?qū)傩浴?/p>

2.3 Hsp70 作為分子伴侶提高肺細胞抗凋亡能力 肺細胞損傷或凋亡是COPD 發(fā)病的重要促進因素。持續(xù)的氣道慢性損傷刺激氣道上皮細胞增生、化生及分泌增加，蛋白酶破壞組織結(jié)構(gòu)及顆粒酶穿孔素損傷肺泡上皮，細胞損傷觸發(fā)凋亡程序?qū)е碌蛲?。當一定?shù)量的肺泡細胞凋亡又不能被新生正常的細胞充分替代，可造成肺泡功能受損和整個肺泡的破壞，最終導致COPD[37]。在顯微鏡下觀察COPD肺組織病理可見肺實質(zhì)破壞、呼吸性細支氣管的擴張和破壞，肺泡壁變薄，肺泡腔擴大、破裂或形成肺大泡，血液供應(yīng)減少。因此，研究Hsp70 抗凋亡蛋白或與相關(guān)輔助蛋白相互作用抑制肺實質(zhì)細胞凋亡對減少COPD 發(fā)病率及疾病進展具有重要意義。Hsp70 已被證實具有抗凋亡功能的分子伴侶，具有識別和指導蛋白質(zhì)多肽正確合成的作用，參與新生多肽的折疊、運輸和降解，降低各種應(yīng)激條件下對細胞的有害影響，有利于維持細胞穩(wěn)定和保持生命力，促進細胞存活[38]。Hsp70 可通過受體介導、線粒體介導或細胞信號通路等途徑發(fā)揮抗細胞凋亡的作用[39-41]。Hsp70 含量減少或Hsp70 敲除后細胞的生存力下降，蛋白穩(wěn)態(tài)破壞和加速細胞凋亡過程[15，42]。因此，肺實質(zhì)細胞內(nèi)維持一定水平的Hsp70 表達促使細胞在感染、炎癥、煙霧、缺氧等各種有害損傷后仍保持生命力減少凋亡，保持呼吸性細支氣管和肺泡功能，對減少COPD 患病具有重要意義。

目前關(guān)于Hsp70 如何發(fā)揮保護細胞作用抵抗細胞凋亡參與到COPD 發(fā)生機制仍在研究中。各種原因引起細胞蛋白穩(wěn)態(tài)失衡導致某些病態(tài)蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有害積累引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與COPD 的發(fā)展有關(guān)[43-44]。據(jù)報道，Hsp70 參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制，在氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[9]。減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以降低或緩解COPD 疾病的風險，研究表明腺苷酸激活蛋白酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通過激活FOXO1 上調(diào)氧調(diào)節(jié)蛋白150（ORP150）轉(zhuǎn)錄，抑制FOXO1 促進細胞凋亡的通路，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及降低炎癥因子的分泌，減少細胞凋亡以實現(xiàn)保護氣道的作用[45]。AMPK 是細胞能量狀態(tài)的關(guān)鍵傳感器，當細胞受到應(yīng)激時AMPK 被激活磷酸化，通過降低炎癥因子IL-8 分泌的途徑在COPD起到保護作用。另外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要標志是抗凋亡分子伴侶ORP150 的激活，ORP150 可以接受白藜蘆醇（激動劑）激活拮抗支氣管上皮細胞暴露于CSE 后誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導的凋亡過程[46]。白藜蘆醇誘導Hsp70 啟動子調(diào)節(jié)的血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）表達，減輕彈性蛋白酶分泌導致的肺氣腫，顯著改善了小鼠COPD 療效[47]，這為臨床治療COPD 提供了新思路。

2.4 Hsp70 與肺功能的關(guān)系 COPD 的特征是持續(xù)存在的氣流受限和相應(yīng)的呼吸系統(tǒng)癥狀，氣流受限惡化成不可逆的氣流受限是COPD 病理生理的核心特征，表現(xiàn)為第一秒用力肺活量（FEV1）/用力肺活量（FVC）及FEV1降低。氣流受限的原因為氣道持續(xù)受到各種刺激后發(fā)生結(jié)構(gòu)上改變，特別是終末呼吸性細支氣管，氣流在小氣道阻力增加，肺泡擴張后彈性回縮力下降。根據(jù)COPD 的診治指南，肺功能檢查是診斷COPD 的“金標準”，也是評估疾病嚴重程度、監(jiān)測疾病進展、評價預后及治療反應(yīng)最常用的客觀指標。據(jù)報道，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）基因的多態(tài)性可能與肺功能的下降有關(guān)[48-49]，MMP 可破壞肺結(jié)締組織的彈性蛋白，損傷肺上皮細胞引起肺氣腫，其在肺組織中的表達升高與Hsp70 相互作用共同參與調(diào)解肺組織的重塑[50]。在COPD 患者的肺組織中檢測到Hsp70 在基因和蛋白質(zhì)水平上的表達增加，并且Hsp70 表達升高與COPD 的嚴重程度和吸煙狀況密切相關(guān)，被認為是反映炎癥嚴重程度和疾病進展的生物標記物[51]。COPD 具有異質(zhì)性，僅參考Hsp70 單一生物標記物不足以準確評估病情，還需要結(jié)合其他生命標記物或檢查指標，如其他炎癥指標、肺功能等。一項研究表明，COPD 患者血漿中的Hsp70 濃度與支氣管氣流受限的嚴重程度、癥狀負擔和惡化史呈正相關(guān)，與肺功能FEV1和FEV1/FVC 呈負相關(guān)[52]，原因是COPD 病情加重時機體和氣道炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激程度加重，激活機體免疫反應(yīng)，Hsp70 應(yīng)激表達增加作為內(nèi)源性保護蛋白協(xié)助蛋白修復，降低氧化損傷。血清中Hsp70 與IL-1β、ATP 等多參數(shù)對識別COPD 患者具有重要的預測價值，尤其綜合肺功能多參數(shù)對識別COPD 急性加重期（AECOPD）具有重要臨床意義。因此，根據(jù)血清中Hsp70 表達水平結(jié)合臨床上檢測的炎癥指標、肺功能等多參數(shù)綜合評估COPD 病情嚴重程度、治療反應(yīng)及預后。

3 總結(jié)與展望

研究證實了Hsp70 參與了COPD 的發(fā)病過程，但其具體機制及影響因素需要進一步研究。在一些實驗中，細胞內(nèi)和細胞外Hsp70 均可表現(xiàn)出抗炎作用，細胞內(nèi)Hsp70 還具有抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡作用，檢測血清中Hsp70 可以評估COPD 的病情。Hsp70 廣泛參與COPD 的發(fā)病機制，各種調(diào)節(jié)Hsp70 生物活性的因素，如激動劑和抑制劑等在干預COPD 的發(fā)生發(fā)展、靶點治療及改善預后等方面有待進一步研究。