孫 悅,戴求仲，蔣桂韜，黃 璇，李 闖，鄧 萍，孫 濤

(1. 廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131； 3. 珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室(廣西師范大學)，廣西 桂林 541006，4. 湖南省家禽安全生產工程技術研究中心, 湖南 長沙 410128)

腸道是動物體內的消化器官和最大免疫器官，在維持正常營養(yǎng)代謝、免疫防御等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。動物腸道中共生著一個龐大而復雜的微生物群落，主要是細菌、古細菌、真菌等，這些微生物與宿主協(xié)同進化，互相依存，對保障宿主機體穩(wěn)態(tài)和健康方面發(fā)揮著重要作用[3-5]。飼糧類型及其粗纖維、碳水化合物、蛋白質等營養(yǎng)素可調節(jié)腸道微生物菌群的組成[6]，但目前關于飼糧成分對腸道菌群影響的研究主要集中在粗纖維、粗蛋白質水平等方面，飼糧氨基酸成分及水平對腸道菌群影響的研究較少。研究表明，飼糧中氨基酸含量增加對腸道健康具有調節(jié)作用，可減少腸黏膜萎縮[7]，維持腸道微生物菌群平衡[8]。

支鏈氨基酸(BCAAs)在動物體內不能合成，主要通過飼料或人工添加來滿足動物生長需要[9]。BCAAs具有營養(yǎng)機體、提高機體免疫力、調節(jié)蛋白質合成和分解、調節(jié)母畜泌乳、調節(jié)激素和物質代謝等多種重要的生物學功能[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加BCAAs對于維持豬、小鼠、雞及魚類的腸道健康具有重要意義[10,14-17]，主要通過促進腸道發(fā)育以及提高腸道免疫等實現(xiàn)，但BCAAs在鴨飼料中的應用研究較少，尤其對鴨腸道菌群是否存在影響尚不清楚。本研究以28～63日齡攸縣麻鴨作為研究對象，探討不同比例BCAAs飼糧對其盲腸微生物多樣性的影響，以期為鴨的腸道健康研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

攸縣麻鴨購于湖南衡東綠然家禽飼養(yǎng)合作社，BCAAs中Leu、Ile、Val均為分析純。試驗飼糧參照地方標準《臨武鴨營養(yǎng)需要》(DB43/T 898—2014)配制，飼糧中亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)按質量比m(Leu)∶m(Val)∶m(Ile)分為1∶0.4∶0.3(MA組)、1∶0.5∶0.4(MB組)、1∶0.6∶0.5(MC組)、1∶0.7∶0.6(MD組)、1∶0.8∶0.7(ME組)和1∶0.9∶0.8(MF組)共6組，其中BCAAs總營養(yǎng)水平基本保持一致，以Leu為1來設置與調節(jié)三者的含量，其他營養(yǎng)水平各組基本一致，配方組成和營養(yǎng)成分見表1。

表1 飼料配方及主要成分表(風干基礎)

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理

選用28日齡健康、體質量相近(587.96±4.44) g(P>0.05)的攸縣麻鴨公鴨504羽，隨機分成6個處理(每處理飼喂1種試驗飼糧)，每處理6個重復，每重復14羽試鴨，試驗全期35 d。試驗在湖南省畜牧獸醫(yī)研究所試驗鴨場進行。試鴨采用網上平養(yǎng)，自由采食與飲水，常規(guī)免疫，定期消毒，飼養(yǎng)規(guī)程按常規(guī)操作進行。

1.2.2 樣品采集

試驗結束后稱量，試鴨末質量(1 222.13±62.39) g(P>0.05)。從每重復中選取1羽接近該處理平均體質量的試鴨進行屠宰，在無菌操作條件下采集盲腸內容物分裝于滅菌EP管后，迅速置于液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.2.3 高通量測序

1.2.3.1 樣品DNA提取

利用DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)提取盲腸內容物總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。采用DS-11型超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的濃度和純度，-80 ℃保存。

1.2.3.2 建庫測序

提取樣品總DNA后，根據16S rDNA V3～V4 區(qū)設計得到引物(338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化，形成測序文庫。建好的文庫先進行質檢，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行高通量測序。

1.2.4 數據統(tǒng)計與分析

從測序平臺得到的原始圖像數據文件，經堿基識別分析轉化為原始測序序列，將測序得到的雙端序列數據拼接成一條序列Tags；同時，對測序序列進行質控過濾，得到有效數據后進行OTU劃分和物種注釋，并作物種多樣性分析以及組間差異分析。用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件與ANOVA進行分析，以Duncan氏作多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 測序序列及OTU分析

通過測序共得到2 244 524條有效序列，將有效序列進行聚類并劃分OTU。對OTU進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)每組樣品的OTU覆蓋率均在99.9%以上，表明該測序能夠真實反映各組樣品的微生物組成。樣品測定結果見表2和圖1。

表2 樣品OTU

圖1展示了6組樣品共有和特有的OTU信息，中間數字代表所有樣品共有的OTU數目，花瓣上數字代表特有OTU數目，可見6組共有的OTU數目為344，僅MD組存在特有的OTU，數目為1。

2.2 BCAAs比例與攸縣麻鴨腸道菌群組成

圖1 OTU韋恩圖Fig. 1 OTU Venn chart

2.2.1 基于門分類水平分析

6組盲腸內容物的所有序列鑒定為14個門。通過與數據庫進行比對，對OTU進行物種分類并選取相對豐度排名前10的門類繪制物種相對豐度柱狀圖(圖2)。排名前10的門類依次為擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、螺旋體門Spirochaetes、梭桿菌門Fusobacteria、脫鐵桿菌門Deferribacteres、無壁菌門Tenericutes、Patescibacteria門和迷蹤菌門Elusimicrobia。6組核心菌群均為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，其中MD組在3種核心菌群的總豐度最高(92.82%)，MA組最低(84.02%)。6組的三大核心菌群總相對豐度差異不顯著(P>0.05)。由表3可知，ME組變形菌門豐度(11.10%±6.09%)顯著低于MD組(P<0.05)；MF組放線菌門豐度(7.29%±5.14%)顯著高于MA組(P<0.05)。6組其他菌門相對豐度的差異不顯著(P>0.05)。

一種顏色代表一個物種，色塊長度表示物種所占相對豐度比例圖2 門水平上物種的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of species at the phylum level

表3 門水平物種相對豐度差異

續(xù)表3 %

2.2.2 基于屬分類水平分析

對盲腸腸道菌群中豐度最高的10個屬進行統(tǒng)計作圖，結果如圖3所示，排名前10的菌屬為擬桿菌屬Bacteroides、脫硫弧菌屬Desulfovibrio、厭氧螺菌屬Anaerobiospirillum、Subdoligranulum屬、Alistipes屬、Faecalibacterium屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group屬、短螺旋菌屬Brachyspira、梭桿菌屬Fusobacterium以及賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus。由圖3可知，屬水平上優(yōu)勢菌屬在各組間略有不同。其中，MA、MB、MC、ME組的第一優(yōu)勢菌屬均為擬桿菌屬，MA、MB、MC組的第二優(yōu)勢菌屬為脫硫弧菌屬；MD組的第一、第二優(yōu)勢菌屬為賴氨酸芽孢桿菌屬和擬桿菌屬，ME組的第二優(yōu)勢菌屬為Subdoligranulum屬，6個試驗組各菌屬之間的差異不顯著。

圖3 屬水平上物種相對豐度Fig. 3 Relative abundance of species at the genus level

2.3 BCAAs比例與攸縣麻鴨腸道菌群結構及多樣性

2.3.1 腸道菌群Alpha多樣性分析

腸道菌群Alpha多樣性指數分析結果見表4。Ace和Chao1指數數值越大，物種越豐富。Shannon數值越大，Simpson數值越小，物種多樣性越高。6個組的Ace和Chao1指數值的差異不顯著；MF組Shannon指數值大于MC組(P<0.05)，Simpson指數值小于MC組(P<0.01)和MA組(P<0.05)，表明MF組的微生物物種多樣性最高，MC組最低。

表4 Alpha多樣性指數分析結果

2.3.2 腸道菌群Beta多樣性分析

腸道菌群Beta多樣性的主坐標分析(PCoA)和無度量多維標定法(NMDS)分析結果見圖4。將數據以點的形式反映在二維坐標圖上，樣本距離越近，表示物種組成結構越相似。6個組樣本極大程度聚集在一起，微生物群落結構的差異顯著(P>0.05)，表明6個組樣本的微生物群落結構具有較高的相似性。

點分別表示各樣品；不同顏色代表不同分組；橫、縱坐標為導致樣品間差異最大的2個特征值，以百分數的形式體現(xiàn)主要影響程度圖4 PCoA和 NMDS分析結果Fig. 4 PCoA and NMDS analysis chart

3 討論

3.1 BCAAs比例對攸縣麻鴨腸道菌群組成的影響

腸道微生物主要是指腸道細菌，由有益菌、致病菌及中性菌構成，腸道細菌種群多達500 種，但這些種主要歸屬于少數的幾個門類[18]。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是單胃大型動物與小型動物腸道的兩大優(yōu)勢門類[18]。除去以上兩大優(yōu)勢門類，鼠腸道中的主要菌群還有變形菌門與脫鐵桿菌門[19]，反芻動物和雞腸道中主要菌群還有變形菌門[20-21]。本研究中，兩大優(yōu)勢門類為厚壁菌門和擬桿菌門，這與前人研究結果[18-21]相一致，第三大優(yōu)勢門類為變形菌門，與反芻動物和雞腸道主要菌群更為一致。以上結果表明，動物腸道的優(yōu)勢門類不會被輕易改變，但飼糧中添加BCAAs會對其中部分主要菌門有一定的影響。另有研究指出，15月齡小鼠腸道中BCAAs補充組的擬桿菌門豐度較對照組下降3.9%，厚壁菌門豐度上升3.62%，變形菌門作為其第三優(yōu)勢門類在補充組中的豐度遠遠低于對照組[17]，而變形菌門中通常包含較多的致病菌，因此，補充BCAAs可能有助于降低腸道菌群中的致病菌。結合本研究，ME組變形菌門豐度最低且顯著低于MD組，可以推測BCAAs中Leu比例在三者中為37%～40%時，更有益于攸縣麻鴨的腸道健康。本研究還發(fā)現(xiàn)MF組放線菌門豐度顯著高于MA組，放線菌門中通常包含較多的共生菌與益生菌，所以MF組可能更有益于攸縣麻鴨腸道菌群。

屬水平上，BCAAs比例對豐度前10的菌屬均無顯著影響，然而各組間仍有一定差異。擬桿菌是腸道中的共生菌，為身體提供必需的營養(yǎng)，在MC與MF組中豐度最高；脫硫弧菌是常見的致病菌，在MA組的豐度最高。BCAAs可以被腸腔內的細菌利用[22-24]，提示它們可能參與調節(jié)腸道菌群的組成。在對小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)BCAAs能夠影響其腸道菌群的結構，并增加潛在益生菌雙歧桿菌的豐度和降低致病菌腸桿菌的比例[17]。本研究中MF組出現(xiàn)較多的雙歧桿菌。此外，豬的低蛋白飲食降低了腸道乳酸菌水平，但BCAAs平衡顯著改善了乳酸菌的增殖[25]；Ile促進了鯉魚腸中乳酸桿菌和芽孢桿菌的生長，抑制了氣單胞菌和大腸桿菌的生長[26]。然而對仔豬的研究中卻發(fā)現(xiàn)BCAAs補充組與正常蛋白組的結腸微生物菌群沒有差異[22]。以上表明，BCAAs對腸道菌群一定是有影響的，得到不一致的結果可能與動物品種、飼料組成和BCAAs添加水平以及比例等問題有關。因此，需要進一步深入研究來揭示BCAAs對機體腸道菌群的影響。

3.2 BCAAs比例對攸縣麻鴨腸道菌群結構與多樣性的影響

Yang等[17]研究指出，補充BCAAs使小鼠腸道微生物多樣性更豐富；文獻[22-24]認為，BCAAs通過被腸道中細菌利用進而可能參與腸道微生物種類和多樣性的調節(jié)。但目前沒有發(fā)現(xiàn)BCAAs比例對腸道菌群影響的研究。在本研究中，Alpha多樣性分析結果表明，6組Ace和Chao1指數無顯著差異(即6組具有相同的物種豐度)，而MF組Shannon指數顯著大于MC組，Simpson指數極顯著小于MC組和MA組。在相同物種豐度條件下，Shannon指數越大，Simpson指數越小，說明物種多樣性越高，由此可見，在本研究條件下，MF組具有最高的微生物多樣性，MC組腸道微生物多樣性最低。在Beta多樣性分析中，PCoA與NMDS分析都是采取降維的思想對多樣本數據進行定位、分析和歸類，而NMDS分析克服了以前排序方法(包括PCoA在內)的缺點，更具有可靠性。結合OTU聚類分析發(fā)現(xiàn)，雖然MD組具有一特有的OTU，但6組微生物菌落結構仍具有較高的相似性，表明不同BCAAs比例在該研究條件下沒有對攸縣麻鴨的腸道菌群結構造成影響。

4 結論

63日齡攸縣麻鴨盲腸的核心菌群是擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，BCAAs比例顯著影響變形菌門及放線菌門，當亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸的質量比m(Leu)∶m(Val)∶m(Ile)=1∶0.9∶0.8時，攸縣麻鴨盲腸微生物物種多樣性最高。