賀思諾， 李銀玲， 周 晶， 周 潔， 林萬華*， 楊文賢

(1．廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541004； 2. 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；3．中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101)

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試動(dòng)物及細(xì)胞

8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠9只(購自湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，小鼠體質(zhì)量為(23.8±2.04) g，飲食自由，室溫維持在(24±2) ℃，通風(fēng)換氣10～12次/d，晝夜時(shí)長1∶1，每組小鼠具有獨(dú)立換氣系統(tǒng)。飼養(yǎng)3～4 d并觀察小鼠生長狀態(tài)，確保良好。SK-BR3細(xì)胞系和A549細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院細(xì)胞文庫。

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、青/鏈霉素均購自美國Gibco公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma-Aldrich公司；PBS溶液購自美國Hyclone公司；Trizol Reagent購自美國Ambion公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied biosystems公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色液購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；SDR9C7-siRNA試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司)、微量臺(tái)式離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)、普通PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及脂多糖誘導(dǎo)ALI模型的建立

銣礦石中金屬礦物總體含量低，僅占礦物總量的1.5%，尤其在礦物粒度較細(xì)的礦石中金屬礦物含量更低，且金屬礦物粒度也相對(duì)較小。金屬礦物主要分布于脈石粒度為中-粗粒的礦石當(dāng)中。非金屬礦物石英、云母普遍粒度粗大，云母結(jié)晶完好。礦石次生蝕變微弱，以塊狀花崗巖、云英巖化花崗巖為主。

參考文獻(xiàn)[8]方法，利用脂多糖(LPS)建立ALI模型：取9只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組、第3天組(LPS誘導(dǎo)的第3天終止實(shí)驗(yàn))和第7天組(LPS誘導(dǎo)的第7天終止實(shí)驗(yàn))，每組3只，所有小鼠用乙醚進(jìn)行麻醉；空白組小鼠經(jīng)鼻腔滴注50 μL PBS溶液，第3天組和第7天組小鼠經(jīng)鼻腔滴注50 μL 6 mg/kg的LPS溶液誘導(dǎo)ALI模型，分別在LPS誘導(dǎo)第3天后和第7天后觀察相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察及病理評(píng)分

采用HE染色法觀察肺組織病理學(xué)，操作步驟如下：取適量小鼠肺組織制作石蠟切片，脫蠟后蒸餾水潤濕組織，蘇木精染色5 min，水沖洗5 s，伊紅染色30 s，再用水沖洗后濾紙吸干，用無水乙醇脫水，封固后在光學(xué)顯微鏡下觀測染色結(jié)果。同時(shí)，參照Turhan等[9]方法，由2名病理科醫(yī)師雙盲狀態(tài)下使用100倍光鏡觀察，對(duì)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張、透明膜形成等5個(gè)檢查項(xiàng)分別進(jìn)行0～4分的主觀定量評(píng)分：標(biāo)本無損傷0分，滿視野為4分，病理評(píng)分為上述各項(xiàng)之和。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)檢測

為了檢測肺組織白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6和Sdr9c7基因的表達(dá)情況，取適量小鼠肺組織置于研磨器中，加入液氮粉碎研磨，采用Trizol法提取組織總RNA，每個(gè)總反應(yīng)體系為20 μL：qPCR SYBR?Green Master Mix (No Rox) 10 μL，F(xiàn)orward Primer (10 μmol/L) 0.5 μL，Reverse Primer (10 μmol/L) 0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。混勻以上樣品和試劑，采用三步法PCR反應(yīng)程序：第一步95 ℃預(yù)變性5 min；第二步95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；第三步熔解曲線為儀器默認(rèn)設(shè)置。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以2-ΔΔCT方法計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)引物見表1。

表1 RT-qPCR上下游引物

1.2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 SDR9C7-小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制效果驗(yàn)證

A549細(xì)胞系復(fù)蘇、培養(yǎng)后，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，以1×105/孔接種于96孔板中。設(shè)立4個(gè)平行復(fù)孔，在3個(gè)復(fù)孔中分別加入SDR9C7-siRNA1、SDR9C7-siRNA2和SDR9C7-siRNA3干擾物，其余1個(gè)復(fù)孔未加入任何干擾物為空白對(duì)照。處理24 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，按照1.2.3節(jié)步驟檢測各組細(xì)胞Sdr9c7基因相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相關(guān)SDR9C7-siRNA引物見表2。

表2 SDR9C7-siRNA核苷酸序列

1.2.4.2 敲低Sdr9c7基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6基因表達(dá)的影響

A549細(xì)胞系復(fù)蘇、培養(yǎng)后，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，以1×105/孔接種于96孔板中。設(shè)立4個(gè)平行復(fù)孔分為4組，對(duì)照組不做任何處理，誘導(dǎo)組加入LPS，敲低組加入SDR9C7-siRNA3干擾物，聯(lián)合組同時(shí)加入LPS和SDR9C7-siRNA3干擾物。處理24 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，按照1.2.3節(jié)步驟檢測各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α和IL-6、Sdr9c7基因相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ALI模型小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察及病理評(píng)分

HE染色結(jié)果顯示(圖1)，LPS誘導(dǎo)的ALI模型小鼠表現(xiàn)出明顯的病理損傷。經(jīng)過比較病理評(píng)分(表3)發(fā)現(xiàn)：與空白組比較，第3天組和第7天組肺水腫評(píng)分、肺泡及間質(zhì)炎癥評(píng)分以及總病理評(píng)分升高；與第3天組比較，第7天組肺泡及間質(zhì)炎癥評(píng)分和總病理評(píng)分降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 Sdr9c7、IL-1β、TNF-α和IL-6基因在ALI模型小鼠肺組織中表達(dá)

與空白組比較，第3天組和第7天組Sdr9c7、IL-1β、TNF-α和IL-6基因相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，第3天組Sdr9c7、IL-1β、TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量高于第7天組，第3天組IL-6基因相對(duì)表達(dá)量低于第7天組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01，圖2A～D)。

圖1 小鼠肺組織HE染色結(jié)果(×100)Fig. 1 Results of HE staining in mice lung tissue (×100)

表3 LPS誘導(dǎo)的ALI模型小鼠肺的病理評(píng)分

與空白組比較，**表示P<0.01；與第3天組比較，##表示P<0.01圖2 Sdr9c7、IL-1β、 TNF-α和IL-6基因在ALI模型小鼠肺組織中表達(dá)情況Fig. 2 Expression of Sdr9c7, IL-1β, TNF-α and IL-6 genes in lung tissue of mice with acute lung injury

2.3 ALI模型小鼠肺組織Sdr9c7基因表達(dá)與病理評(píng)分相關(guān)性分析

ALI模型小鼠肺組織Sdr9c7基因表達(dá)與病理評(píng)分相關(guān)性分析結(jié)果如圖3所示，小鼠肺組織Sdr9c7基因相對(duì)表達(dá)量與病理評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.964，P<0.01)。

2.4 敲低Sdr9c7基因表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果

敲低Sdr9c7基因表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示，Sdr9c7基因表達(dá)在空白對(duì)照、SDR9C7-siRNA1、SDR9C7-siRNA2和SDR9C7-siRNA3中依次降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，提示SDR9C7-siRNA3敲低Sdr9c7基因表達(dá)效果更明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SDR9C7-siRNA3作為敲低Sdr9c7基因表達(dá)的干擾序列。

圖3 小鼠肺組織Sdr9c7基因表達(dá)與病理評(píng)分相關(guān)性分析結(jié)果Fig. 3 Correlation analysis of Sdr9c7 gene expression and pathological score in lung tissue of mice

與空白對(duì)照比較，**表示P<0.01；與siRNA1比較，##表示P<0.01；與siRNA2比較，△△表示P<0.01圖4 敲低Sdr9c7基因表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 Verification results of low Sdr9c7 gene expression

2.5 敲低Sdr9c7基因?qū)PS誘導(dǎo)A549細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6基因表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測IL-1β、TNF-α、IL-6、Sdr9c7基因相對(duì)表達(dá)量(圖5)，與空白對(duì)照組比較，LPS誘導(dǎo)組升高(均P<0.05)，而Sdr9c7基因siRNA敲低組和聯(lián)合組下降(均P<0.05)，且敲低組甚至低于聯(lián)合組(均P<0.05)。

與空白對(duì)照組比較，*表示P<0.05；與誘導(dǎo)組比較，#表示P<0.05；與敲低組比較，△表示P<0.05圖5 敲低Sdr9c7基因?qū)PS誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of knockdown Sdr9c7 gene on expression of LPS induced cytokines in A549 cells

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)呼吸道吸入LPS，可引起肺組織明顯的病理損傷。比較不同時(shí)間段終止實(shí)驗(yàn)的小鼠肺組織病理形態(tài)改變情況發(fā)現(xiàn)：第3天終止實(shí)驗(yàn)和第7天終止實(shí)驗(yàn)的小鼠肺水腫、肺部炎癥情況比正常小鼠嚴(yán)重，而第3天終止實(shí)驗(yàn)的小鼠肺部炎癥比第7天終止實(shí)驗(yàn)的小鼠嚴(yán)重。進(jìn)一步對(duì)3組小鼠肺部進(jìn)行評(píng)分，發(fā)現(xiàn)第3天終止實(shí)驗(yàn)小鼠病理評(píng)分最高，其次為第7天終止實(shí)驗(yàn)小鼠，提示小鼠肺部吸入LPS可引起肺損傷；第7天終止實(shí)驗(yàn)的小鼠肺部損傷較第3天終止實(shí)驗(yàn)的小鼠輕，體現(xiàn)出肺損傷的急性反應(yīng)，成功建立急性ALI模型。

IL-1β是體內(nèi)作用最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)之一，能夠介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)下游幾百種二級(jí)炎癥因子的合成與表達(dá)，對(duì)炎癥有放大和促進(jìn)效應(yīng)[10]。TNF-α是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用[11]。當(dāng)組織損傷部位或病原體入侵發(fā)出防御信號(hào)時(shí)，IL-6刺激急性免疫反應(yīng)，為宿主防御做好準(zhǔn)備，其過量持續(xù)產(chǎn)生可作為一種促炎因子[12]。檢測3組IL-1β、TNF-α和IL-6基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)第3天終止實(shí)驗(yàn)和第7天終止實(shí)驗(yàn)小鼠相對(duì)表達(dá)量較正常小鼠升高，第3天終止實(shí)驗(yàn)小鼠高于第7天終止實(shí)驗(yàn)小鼠，與相關(guān)研究ALI模型中IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)異常升高結(jié)果[13-15]相一致，證實(shí)了炎癥反應(yīng)與肺損傷作用密切聯(lián)系。

目前，關(guān)于SDR9C7基因的研究報(bào)道文獻(xiàn)并不多見，其在ALI的作用研究也鮮見報(bào)道，SDR9C7基因參與組織細(xì)胞的生理功能仍不是很清楚。以往研究發(fā)現(xiàn)，SDR9C7可催化酰基甲酰胺的臨界脫氫形成皮膚屏障[3，16]，然而大部分SDR9C7基因關(guān)聯(lián)研究大多聚焦于魚鱗病的發(fā)生，證實(shí)SDR9C7基因與魚鱗病發(fā)生密切相關(guān)[4，17]， 即SDR9C7基因可以通過調(diào)節(jié)和合成神經(jīng)酰胺影響皮膚疾病的結(jié)局。此外，相關(guān)研究顯示，抑制神經(jīng)酰胺表達(dá)的酸性鞘磷脂酶抑制劑或特異性敲除酸性鞘磷脂酶基因?qū)LI模型治療具有積極作用[18]?；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn)，SDR9C7基因異常表達(dá)可以影響肺損傷。本研究結(jié)果顯示，3組小鼠肺組織的Sdr9c7基因表達(dá)趨勢與IL-1β、TNF-α和IL-6基因表達(dá)趨勢一致，Sdr9c7基因表達(dá)與病理評(píng)分呈正相關(guān)，因此可以推測LPS作用小鼠肺組織可影響Sdr9c7基因異常表達(dá)，而Sdr9c7基因異常表達(dá)與影響炎癥反應(yīng)加重肺損傷發(fā)揮重要的作用。為驗(yàn)證以上推測，利用敲除SDR9C7基因效果最好的SDR9C7-siRNA3，通過敲低Sdr9c7基因表達(dá)，觀察SDR9C7-siRNA3和LPS干預(yù)A549細(xì)胞后，IL-1β、TNF-α、IL-6、Sdr9c7基因的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，LPS干預(yù)A549細(xì)胞，IL-1β、TNF-α、IL-6、Sdr9c7基因表達(dá)顯著升高，SDR9C7-siRNA3干預(yù)A549細(xì)胞，敲低了Sdr9c7基因表達(dá)，同時(shí)IL-1β、TNF-α、IL-6基因表達(dá)水平也異常降低，結(jié)果表明Sdr9c7基因異常表達(dá)，可影響A549細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

綜上所述，急性肺損傷模型小鼠肺組織Sdr9c7基因異常表達(dá)，與肺損傷病理評(píng)分呈正相關(guān)；肺損傷機(jī)制可能與SDR9C7基因高表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用相關(guān)。