石艷賓，梁山，李文靜，黃登禹*

1.天津天獅學院（天津 301700）；2.天津嘉匯捷瑞醫(yī)藥科技有限公司（天津 301800）

為增強抗氧化效果，在抗氧化劑中添加一種或幾種其他抗氧化劑，使復配抗氧化劑各組分間特性互補、協(xié)調增效，從而大大提高抗氧化能力[1-3]。沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）亦稱棓酸丙酯，屬于酚類化合物，具有顯著的藥理活性和生物活性，是一種常見的脂溶性抗氧化劑[4-5]，主要用于抗氧化和抗微生物等方面。茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶葉中多羥基酚類化合物的總稱[6]，是一種具有高抗氧化性和強抑菌性的天然提取物，易溶于水和有機溶劑，其抗氧化能力是維生素C的100倍，是維生素E的20倍，安全無毒、耐熱性好，被廣泛應用于植物蛋白飲料、蛋白固體飲料等制品中[7]。D-異抗壞血酸鈉（D-sodium erythorbate）又名赤藻糖酸鈉，是一種安全性高、性能優(yōu)良的新型生物型抗氧化劑和護色劑，其防腐抗氧的效果優(yōu)于VC，易溶于水，被廣泛用于濃縮果蔬汁、飲料、葡萄酒、果醬等食品中[8]。Romano等[9]研究指出，迷迭香酸提取物和BHT等量混合后具有協(xié)同抗氧化作用以及抗菌活性的增效性。唐煜括等[10]研究發(fā)現(xiàn)漢中仙毫茶多酚與維生素C以特定比例混合后，自由基清除活性和抑菌性均有顯著提高。王鵬等[11]研究黑木耳中多糖和類黃酮的協(xié)同抗氧化作用，自由基清除能力隨著復配液質量濃度增大而增強。Hait-Darshan等[12]從菠菜葉中分離提取了一種天然抗氧化物質（NAO），結果發(fā)現(xiàn)咖啡酸和兒茶素與NAO復配具有更好的抗氧化協(xié)同效果。Jaswir等[13]將響應曲面法應用于抗氧化協(xié)同作用分析，為復配抗氧化劑的配比篩選提供了依據。Zhang等[14]從扁豆中提取出類胡蘿卜素和生育酚，結果發(fā)現(xiàn)二者之間具有協(xié)同抗氧化作用。隨著食品種類的不斷豐富，單一抗氧化劑不能滿足食品行業(yè)的發(fā)展要求，因此復配抗氧化劑是已逐漸成為時代抗氧化劑發(fā)展的必然趨勢。依據GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》，篩選出用于糖果包衣中的抗氧化劑沒食子酸丙酯、茶多酚，并輔以一定量兼具抗氧化與護色作用的D-異抗壞血酸鈉，利用響應面法優(yōu)化出復配抗氧化劑組合，為復配食品抗氧化劑在食品抗氧化防護應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-抗壞血酸（純度≥99）、沒食子酸丙酯（純度≥98%）、茶多酚（純度≥97）、D-異抗壞血酸鈉（純度≥98%），上海麥克林生化科技有限公司；DPPH（純度≥99.99%），梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；無水乙醇（分析純），天津市匯杭化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV1000紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；SB-3200DTDN超聲波清洗機，廣州譜立奇儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力測定

將VC、茶多酚、PG、D-異抗壞血酸鈉配制成5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL系列樣品溶液，以VC為對照，采用DDPH法測定抗氧劑樣品自由基清除率，分析3種抗氧化劑的抗氧化性能。分別移取0.5 mL待測樣品溶液、70%乙醇溶液，加入5 mL濃度為0.06 mmol/L DPPH溶液，混合混勻后靜置反應30 min，在吸收波長515 nm處測定系列樣品溶液反應后Ar、空白對照Ac；移取0.5 mL待測樣品溶液和5 mL 70%乙醇溶液，混合混勻后靜置反應，測定樣品底液Ax[15-16]。根據式（1）計算VC、PG、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉樣品的DPPH自由基清除率SR值，制作抗氧化劑濃度與自由基清除率SR值曲線圖，計算半數(shù)清除率IC50值。

1.3.2 響應面試驗

根據茶多酚、沒食子酸丙酯、D-異抗壞血酸鈉DPPH自由基半數(shù)清除率IC50值及食品添加劑使用控制要求[17-18]，3種抗氧化劑的優(yōu)水平分別為10，15和35 μg/mL。采用Design Expert 10軟件，設計Box-Behnken因素水平編碼表1，進行響應面分析試驗，分析3種抗氧化劑對DPPH自由基清除率SR值的影響。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平編碼表單位：μg/mL

2 試驗結果與分析

2.1 茶多酚、PG、D-異抗壞血酸鈉DPPH自由基清除能力分析

依據試驗方法1.3.1小節(jié)，測定TP、PG、D-異抗壞血酸鈉系列濃度樣品溶液SR值，繪制抗氧化劑質量濃度與自由基清除率SR間的曲線圖，得到抗氧化劑回歸方程與R2，計算TP、PG、D-異抗壞血酸鈉半數(shù)清除率IC50值，詳見圖1和表2。由圖1和表2可知，抗氧化劑TP、PG、D-異抗壞血酸鈉對DPPH自由基均有較強的清除作用，清除率SR值隨著樣品濃度的增大而增強，但達到60 μg/mL，DPPH自由基清除率能力增長緩慢。將TP、PG、D-異抗壞血酸鈉清除能力與對照VC進行比較分析可知，抗氧化劑在60 μg/mL以下質量濃度下茶多酚TP、PG對DPPH自由基的清除作用強于VC，D-異抗壞血酸鈉弱清除能力弱于VC。

表2 TP、PG、D-異抗壞血酸鈉和VC回歸方程與半數(shù)清除率

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果

在分析TP、PG、D-異抗壞血酸鈉清除自由基能力作用的基礎上，依據因素水平編碼表1進行Box-Behnken響應面試驗設計，分析TP、PG、D-異抗壞血酸鈉對DPPH自由基清除率的影響，Box-Behnken響應面試驗結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計與結果

2.2.2 響應面試驗結果方差分析

應用Design Exper 10對響應面試驗結果表3中試驗數(shù)據進行回歸分析，方差分析結果詳見表4。沒食子酸丙酯（A）、茶多酚（B）、D-異抗壞血酸鈉（C）的p值均小于0.01，表明這3個因素對DPPH自由基清除率的影響非常顯著。A、B、C三個因素間存在一定的交互作用，但只有A與C間交互作用對DPPH自由基清除率的影響顯著，A與B、B與C間交互作用較小。

表4 回歸模型方差與分析

2.2.3 回歸模型的建立及抗氧化性分析

對響應面試驗結果進行回歸分析，建立全變量二次回歸模型：

由表4可知：模型p＜0.01，表明回歸模型非常顯著；失擬項p=0.508 8＞0.05，即失擬項不顯著，表明該模型是適合沒食子酸丙酯、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉協(xié)同抗氧化分析的數(shù)學模型。試驗的校正R2值為0.950 9，表明回歸方程的擬合度較好?；貧w方程系數(shù)的顯著性結果表明：A、B、C對DPPH自由基清除率的影響非常顯著，對DPPH自由基清除率影響依次B、A、C；AC、C2對DPPH自由基清除率的影響顯著。因素A、B一次項系數(shù)為正值，表明A、B對DPPH自由基清除率有正相關性，因素C一次項系數(shù)為負值，表明C對DPPH自由基清除率有負相關性；A與B交互項系數(shù)為正值，表明兩因素間對DPPH自由基清除率存在正協(xié)同作用；A與C、B與C的交互作用系數(shù)為負值，表明兩因素間對DPPH自由基清除率存在負協(xié)同作用。

2.2.4 響應面交互作用分析

應用Design Expert 10對表3數(shù)據進行分析，并繪制出響應曲面圖2~圖4。隨著抗氧化劑質量濃度的增加，DPPH自由基清除率SR值也隨著增大。同時，響應曲面坡度比較陡峭，說明抗氧化物質對DPPH自由基清除率的影響顯著，茶多酚的清除效果明顯強于沒食子酸丙酯。從3個響應曲面圖也可以看出，雖然沒食子酸丙酯、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉間存在一定的交互作用，但因素沒食子酸丙酯與D-異抗壞血酸鈉間存在負協(xié)同作用，導致響應面試驗設計部分復配組合隨著兩種抗氧化劑質量濃度增大出現(xiàn)自由基清除率降低現(xiàn)象。

圖2 A和C對DPPH自由基清除率的影響

圖3 A和B對DPPH自由基清除率的影響

圖4 B和C對DPPH自由基清除率的影響

2.2.5 優(yōu)化配方驗證試驗

采用單因素試驗和響應面試驗確定優(yōu)化復配組合：沒食子酸丙酯14.90 μg/mL、茶多酚15.00 μg/mL、D-異抗壞血酸鈉40.00 μg/mL。為了便于實施試驗，將配方參數(shù)修正為沒食子酸丙酯15 μg/mL、茶多酚15 μg/mL、D-異抗壞血酸鈉40 μg/mL，重復試驗進行3次驗證，取平均值，結果為58.647%，表現(xiàn)出較好的抗氧化效果，證明該復配組合為較優(yōu)方案。

3 結論

沒食子酸丙酯、茶多酚為典型的酚型抗氧化劑，D-異抗壞血酸鈉兼具抗氧化與護色作用。經比較，沒食子酸丙酯、茶多酚抗氧化性強于對照品VC，D-異抗壞血酸鈉弱于VC。利用響應面法分析可知，沒食子酸丙酯、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉對DPPH自由基清除作用顯著，沒食子酸丙酯與D-異抗壞血酸鈉間交互作用顯著，且為負協(xié)同作用。最佳配方為沒食子酸丙酯15 μg/mL、茶多酚15 μg/mL、D-異抗壞血酸鈉40 μg/mL，DPPH自由基清除率為58.647%，抗氧化效果較好。復配抗氧化劑是我國食品添加劑的發(fā)展方向，在今后還需要根據食品添加劑使用要求進行大量試驗，尋求具有典型抗氧化性并能夠對產品進行護色作用的復合抗氧化劑。