王佳樂 李琤 李廣明

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，以往關(guān)于肝癌發(fā)病機制的研究主要集中在傳統(tǒng)蛋白編碼基因[1]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)非編碼RNA(ncRNA)占人類基因組的95%以上，編碼RNA的蛋白質(zhì)與功能性ncRNA之間的相互作用在癌癥的發(fā)展過程中具有重要作用[2]。長ncRNA(lncRNA)作為ncRNA的重要組成部分，已被證明與表觀遺傳、基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和翻譯有關(guān)[3]。X非活性特異性轉(zhuǎn)錄物(XIST)是最近發(fā)現(xiàn)的位于染色體10q26上的lncRNA，XIST在胃癌和結(jié)腸直腸癌中發(fā)揮明顯抑癌作用[4]。既往研究證實miR-548-a-3p參與了HCC，但具體機制有待進一步闡明[5]。miRNA是lncRNA發(fā)揮其生物學功能的重要靶標，生物信息學分析表明，XIST和miR-548-a-3p之間存在結(jié)合位點[6]。目前尚未見lncRNA TSIX在肝細胞癌中的研究，本研究擬探討lncRNA TSIX通過靶向miR-548-a-3p抑制HCC細胞增殖和侵襲的機制，為HCC的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要儀器與試劑

Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Thermo Fisher Scientific)，胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Gibco)，Lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher Scientific)，CCK-8試劑盒(美國Sigma)，WE-986.90酶標儀(美國Bio-Rad),多聚甲醛、結(jié)晶紫(中國碧云天生物科技)、SD-09倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)雙重染色試劑(BD Biosciences)，CV-90流式細胞儀(美國Beckman Coulter)，Matrigel膜(美國Corning)，Transwell腔室(美國BD Biosciences)，TRIzol試劑(美國Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國塔卡拉)，SYBR-Green定量實時PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo)，Tween-20細胞裂解緩沖液(中國碧云天生物科技)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，美國Sigma)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美國賽默飛世)，1%牛血清白蛋白(BSA，上海生工)。

二、細胞培養(yǎng)及其分組設(shè)計

Huh7細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，并在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng) (含有10%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素)，并在在37 ℃、5%CO2的濕潤氣氛中生長。

lncRNA TSIX mimics組、lncRNA TSIX inhibitor組培養(yǎng)方法：載體包括lncRNA TSIX過表達載體(lncRNA TSIX mimics)，lncRNA TSIX低表達載體(lncRNA TSIX inhibitor組)購自Ribo Bio Co，Ltd(中國廣州)。根據(jù)制造商的建議，使用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen，Carlsbad，美國)對載體進行轉(zhuǎn)染，48 h后收集細胞并進行處理以進行進一步的體外研究。

三、Huh7細胞活力的檢測及癌細胞單克隆形成數(shù)目檢測

使用MTT試劑盒測量細胞增殖，將細胞在96孔板中培養(yǎng)，并在細胞孔中加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL)。在37 ℃下孵育4 h后，將MTT替換為150 μL DMSO，并將平板緩慢振搖10 min，通過酶標儀在570 nm下測定每個吸光度。

通過胰蛋白酶消化收集接受不同處理后的細胞，并以1 000個細胞/孔的密度鋪在6孔板上。培養(yǎng)14 d后，將細胞用10%甲醛固定，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，在光學顯微鏡下計數(shù)菌落數(shù)。

四、Huh7細胞凋亡測定

Annexin V-FITC / PI雙重染色結(jié)合流式細胞儀檢測細胞凋亡。將轉(zhuǎn)染的細胞以3×105細胞/孔的密度接種在6孔板中，用0.25%胰蛋白酶消化，消化后用PBS洗滌兩次，加入100 μL結(jié)合緩沖液，依次制成1×106細胞/mL懸浮液。加入膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI，在室溫下于黑暗中孵育5 min，并用FC500MCL流式細胞儀系統(tǒng)檢測。重復實驗3次并取平均值。

五、Huh7細胞遷移水平測定

使用Matrigel Tranwell評估細胞侵襲水平，將經(jīng)過不同處理的細胞重新懸浮在無FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基中，并鋪在上腔室的transwell插入物上。而下腔室則裝有含有20%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基。進一步培養(yǎng)24 h后，將侵襲和遷移的細胞用10%甲醛固定，并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。通過在光學顯微鏡下隨機選擇五個視野來量化侵襲細胞的數(shù)量。

六、Huh7細胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達水平測定

首先，將細胞系制備成細胞懸液。然后，添加TRIzol試劑以提取總RNA。用紫外分光光度計測試提取的總RNA的純度和濃度。使用SYBR-Green Realtime PCR Master mix用miR-26a-5p和HMGA2反轉(zhuǎn)錄總RNA。操作步驟嚴格按照制造商的工具包進行。然后，進行PCR擴增實驗。 PCR反應(yīng)系統(tǒng)如下：cDNA 1 μL，上，下游引物0.4 μL，2×SYBRr-Green Realtime PCR Master mix 10 μL，被動參考染料(50×)0.4 μL，ddH2O添加至20 μL。lncRNA TSIX的PCR反應(yīng)條件如下：在94 ℃預變性45 s，在94 ℃變性10 s，在60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。實驗以U6作為內(nèi)部參照進行了3次。miR-548-a-3p反應(yīng)條件如下：在94 ℃變性10s，在60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。實驗以β-肌動蛋白為內(nèi)參進行了3次。lncRNA TSIX、miR-548-a-3p的特異性引物如下：lncRNA TSIX，正向5-GCACAGGTTAGCGTG-TTTCC-3，反向5-CCCAGTTTCCCAGAGGTCAC-3； miR-548-a-3p，forward5-AACACACCTTTAC-AAGGATTCA-3。β-肌動蛋白，上游序列：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游序列：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

七、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，定量實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組Huh7細胞OD值、存活率比較

由表1可見，lncRNA TSIX mimics組OD值、存活率低于Huh7細胞組(t=8.725、5.437，P<0.05)，lncRNA TSIX inhibitor組OD值、存活率高于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=4.124、3.784、10.462、7.965，P<0.05)。

二、各組Huh7細胞單克隆形成數(shù)目、凋亡率及穿膜數(shù)比較

由表2及圖1、圖2可見，lncRNA TSIX mimics組單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)低于Huh7細胞組，凋亡率高于Huh7細胞組(t=120.834、64.321、10.531，P<0.05)；lncRNA TSIX inhibitor組單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)高于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組，凋亡率低于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=37.192、174.632、30.703、104.562、37.385、48.021，P<0.05)。

表1 各組Huh7細胞OD值、存活率比較

表2 各組Huh7細胞克隆形成數(shù)目、凋亡率及穿膜數(shù)比較

圖1 各組Huh7細胞凋亡流式細胞圖

A: Huh7細胞組；B: lncRNA TSIX mimics組；C: lncRNA TSIX inhibitor組

三、各組Huh7細胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達水平比較

由表3可見，lncRNA TSIX mimics組lncRNA TSIX高于Huh7細胞組，miR-548-a-3p低于Huh7細胞組(t=12.372、11.265，P<0.05)，lncRNA TSIX inhibitor組lncRNA TSIX低于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組，miR-548-a-3p高于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=4.618、9.597、6.612、10.058，P<0.05)。

討 論

具有功能性的lncRNA的異常表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲性生物學行為密切相關(guān)。例如，在人肝癌組織和細胞中，lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)一直增加，這可能成為肝癌的有效生物標志物[7]。在本研究中，lncRNA TSIX mimics組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)低于Huh7細胞組，lncRNA TSIX inhibitor組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)高于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。lncRNA TSIX mimics組凋亡率高于Huh7細胞組，lncRNA TSIX inhibitor組凋亡率低于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。這說明lncRNA TSIX參與了肝癌的發(fā)病和發(fā)展，并可明顯抑制HCC細胞增殖、侵襲，促進HCC細胞凋亡。 lncRNA TSIX已被證明在幾種人類腫瘤中低表達，并在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著抑癌作用[8-9]。在臨床研究中，已經(jīng)觀察到人肝癌組織中l(wèi)ncRNA TSIX表達的顯著下調(diào)，這與其在其他腫瘤中的表達譜一致[10-11]。本研究假設(shè)具有癌抑制作用的lncRNA TSIX在HCC中起一定的作用，并且通過觀察HCC細胞的生物行為學進一步證實了這一結(jié)論。

為了進一步探索肝癌中l(wèi)ncRNA TSIX的精確調(diào)控過程，根據(jù)已發(fā)表的研究和生物信息學分析，推斷miR-548-a-3p可能是lncRNA TSIX的下游靶標。新興研究表明，miRNA屬于ncRNA，在人類HCC中也起著至關(guān)重要的作用，包括miR-548-a-3p[12]。miR-548-a-3p在肝癌組織和血清中上調(diào)，促進細胞生長，與患者預后不良有關(guān)[13]。lncRNA對miRNA的直接或間接調(diào)節(jié)是發(fā)揮其生物學功能的重要機制之一。生物信息學分析表明，lncRNA TSIX可能通過堿基配對相互作用與miR-548-a-3p結(jié)合，表明它們之間的功能相關(guān)性[14]。與lncRNA TSIX相反，臨床研究觀察到miR-548-a-3p在HCC組織和細胞中顯著增加[15]。有趣的是，在肝癌組織中，lncRNA TSIX的表達與miR-548-a-3p呈顯著負相關(guān)，表明它們之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。體外實驗證實，lncRNA TSIX負調(diào)控miR-548-a-3p的表達，這可能取決于直接組合，但具體機制尚待進一步研究。本研究中，lncRNA TSIX mimics組lncRNA TSIX 高于Huh7細胞組，miR-548-a-3p 低于Huh7細胞組(P<0.05)；lncRNA TSIX inhibitor組lncRNA TSIX 低于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組，miR-548-a-3p高于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。這說明，lncRNA TSIX的上調(diào)過表達逆轉(zhuǎn)了miR-548-a-3p在體外對HCC細胞的生長促進作用。本文數(shù)據(jù)證明，lncRNA TSIX誘導的HCC生長抑制至少部分由負調(diào)節(jié)miR-548-a-3p介導。

表3 各組Huh7細胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達水平比較

綜上所述，lncRNA TSIX明顯抑制HCC細胞增殖、侵襲，促進HCC細胞凋亡；其機制可能與lncRNA TSIX負調(diào)節(jié)miR-548-a-3p有關(guān)。