王佳樂 李琤 李廣明
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,以往關(guān)于肝癌發(fā)病機制的研究主要集中在傳統(tǒng)蛋白編碼基因[1]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,已發(fā)現(xiàn)非編碼RNA(ncRNA)占人類基因組的95%以上,編碼RNA的蛋白質(zhì)與功能性ncRNA之間的相互作用在癌癥的發(fā)展過程中具有重要作用[2]。長ncRNA(lncRNA)作為ncRNA的重要組成部分,已被證明與表觀遺傳、基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和翻譯有關(guān)[3]。X非活性特異性轉(zhuǎn)錄物(XIST)是最近發(fā)現(xiàn)的位于染色體10q26上的lncRNA,XIST在胃癌和結(jié)腸直腸癌中發(fā)揮明顯抑癌作用[4]。既往研究證實miR-548-a-3p參與了HCC,但具體機制有待進一步闡明[5]。miRNA是lncRNA發(fā)揮其生物學功能的重要靶標,生物信息學分析表明,XIST和miR-548-a-3p之間存在結(jié)合位點[6]。目前尚未見lncRNA TSIX在肝細胞癌中的研究,本研究擬探討lncRNA TSIX通過靶向miR-548-a-3p抑制HCC細胞增殖和侵襲的機制,為HCC的治療提供理論依據(jù)。
一、主要儀器與試劑
Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM,Thermo Fisher Scientific),胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Gibco),Lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher Scientific),CCK-8試劑盒(美國Sigma),WE-986.90酶標儀(美國Bio-Rad),多聚甲醛、結(jié)晶紫(中國碧云天生物科技)、SD-09倒置顯微鏡(日本奧林巴斯),膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)雙重染色試劑(BD Biosciences),CV-90流式細胞儀(美國Beckman Coulter),Matrigel膜(美國Corning),Transwell腔室(美國BD Biosciences),TRIzol試劑(美國Invitrogen),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國塔卡拉),SYBR-Green定量實時PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo),Tween-20細胞裂解緩沖液(中國碧云天生物科技),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,美國Sigma),聚偏二氟乙烯膜(PVDF,美國賽默飛世),1%牛血清白蛋白(BSA,上海生工)。
二、細胞培養(yǎng)及其分組設(shè)計
Huh7細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得,并在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng) (含有10%的胎牛血清,100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素),并在在37 ℃、5%CO2的濕潤氣氛中生長。
lncRNA TSIX mimics組、lncRNA TSIX inhibitor組培養(yǎng)方法:載體包括lncRNA TSIX過表達載體(lncRNA TSIX mimics),lncRNA TSIX低表達載體(lncRNA TSIX inhibitor組)購自Ribo Bio Co,Ltd(中國廣州)。根據(jù)制造商的建議,使用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen,Carlsbad,美國)對載體進行轉(zhuǎn)染,48 h后收集細胞并進行處理以進行進一步的體外研究。
三、Huh7細胞活力的檢測及癌細胞單克隆形成數(shù)目檢測
使用MTT試劑盒測量細胞增殖,將細胞在96孔板中培養(yǎng),并在細胞孔中加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL)。在37 ℃下孵育4 h后,將MTT替換為150 μL DMSO,并將平板緩慢振搖10 min,通過酶標儀在570 nm下測定每個吸光度。
通過胰蛋白酶消化收集接受不同處理后的細胞,并以1 000個細胞/孔的密度鋪在6孔板上。培養(yǎng)14 d后,將細胞用10%甲醛固定,然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min,在光學顯微鏡下計數(shù)菌落數(shù)。
四、Huh7細胞凋亡測定
Annexin V-FITC / PI雙重染色結(jié)合流式細胞儀檢測細胞凋亡。將轉(zhuǎn)染的細胞以3×105細胞/孔的密度接種在6孔板中,用0.25%胰蛋白酶消化,消化后用PBS洗滌兩次,加入100 μL結(jié)合緩沖液,依次制成1×106細胞/mL懸浮液。加入膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI,在室溫下于黑暗中孵育5 min,并用FC500MCL流式細胞儀系統(tǒng)檢測。重復實驗3次并取平均值。
五、Huh7細胞遷移水平測定
使用Matrigel Tranwell評估細胞侵襲水平,將經(jīng)過不同處理的細胞重新懸浮在無FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基中,并鋪在上腔室的transwell插入物上。而下腔室則裝有含有20%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基。進一步培養(yǎng)24 h后,將侵襲和遷移的細胞用10%甲醛固定,并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。通過在光學顯微鏡下隨機選擇五個視野來量化侵襲細胞的數(shù)量。
六、Huh7細胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達水平測定
首先,將細胞系制備成細胞懸液。然后,添加TRIzol試劑以提取總RNA。用紫外分光光度計測試提取的總RNA的純度和濃度。使用SYBR-Green Realtime PCR Master mix用miR-26a-5p和HMGA2反轉(zhuǎn)錄總RNA。操作步驟嚴格按照制造商的工具包進行。然后,進行PCR擴增實驗。 PCR反應(yīng)系統(tǒng)如下:cDNA 1 μL,上,下游引物0.4 μL,2×SYBRr-Green Realtime PCR Master mix 10 μL,被動參考染料(50×)0.4 μL,ddH2O添加至20 μL。lncRNA TSIX的PCR反應(yīng)條件如下:在94 ℃預(yù)變性45 s,在94 ℃變性10 s,在60 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。實驗以U6作為內(nèi)部參照進行了3次。miR-548-a-3p反應(yīng)條件如下:在94 ℃變性10s,在60 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。實驗以β-肌動蛋白為內(nèi)參進行了3次。lncRNA TSIX、miR-548-a-3p的特異性引物如下:lncRNA TSIX,正向5-GCACAGGTTAGCGTG-TTTCC-3,反向5-CCCAGTTTCCCAGAGGTCAC-3; miR-548-a-3p,forward5-AACACACCTTTAC-AAGGATTCA-3。β-肌動蛋白,上游序列:5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′,下游序列:5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。
七、統(tǒng)計學分析
采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,定量實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示,采用單因素方差分析比較,多重比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
一、各組Huh7細胞OD值、存活率比較
由表1可見,lncRNA TSIX mimics組OD值、存活率低于Huh7細胞組(t=8.725、5.437,P<0.05),lncRNA TSIX inhibitor組OD值、存活率高于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=4.124、3.784、10.462、7.965,P<0.05)。
二、各組Huh7細胞單克隆形成數(shù)目、凋亡率及穿膜數(shù)比較
由表2及圖1、圖2可見,lncRNA TSIX mimics組單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)低于Huh7細胞組,凋亡率高于Huh7細胞組(t=120.834、64.321、10.531,P<0.05);lncRNA TSIX inhibitor組單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)高于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組,凋亡率低于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=37.192、174.632、30.703、104.562、37.385、48.021,P<0.05)。
表1 各組Huh7細胞OD值、存活率比較
表2 各組Huh7細胞克隆形成數(shù)目、凋亡率及穿膜數(shù)比較
圖1 各組Huh7細胞凋亡流式細胞圖
A: Huh7細胞組;B: lncRNA TSIX mimics組;C: lncRNA TSIX inhibitor組
三、各組Huh7細胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達水平比較
由表3可見,lncRNA TSIX mimics組lncRNA TSIX高于Huh7細胞組,miR-548-a-3p低于Huh7細胞組(t=12.372、11.265,P<0.05),lncRNA TSIX inhibitor組lncRNA TSIX低于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組,miR-548-a-3p高于Huh7細胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=4.618、9.597、6.612、10.058,P<0.05)。
具有功能性的lncRNA的異常表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲性生物學行為密切相關(guān)。例如,在人肝癌組織和細胞中,lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)一直增加,這可能成為肝癌的有效生物標志物[7]。在本研究中,lncRNA TSIX mimics組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)低于Huh7細胞組,lncRNA TSIX inhibitor組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)高于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。lncRNA TSIX mimics組凋亡率高于Huh7細胞組,lncRNA TSIX inhibitor組凋亡率低于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。這說明lncRNA TSIX參與了肝癌的發(fā)病和發(fā)展,并可明顯抑制HCC細胞增殖、侵襲,促進HCC細胞凋亡。 lncRNA TSIX已被證明在幾種人類腫瘤中低表達,并在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著抑癌作用[8-9]。在臨床研究中,已經(jīng)觀察到人肝癌組織中l(wèi)ncRNA TSIX表達的顯著下調(diào),這與其在其他腫瘤中的表達譜一致[10-11]。本研究假設(shè)具有癌抑制作用的lncRNA TSIX在HCC中起一定的作用,并且通過觀察HCC細胞的生物行為學進一步證實了這一結(jié)論。
為了進一步探索肝癌中l(wèi)ncRNA TSIX的精確調(diào)控過程,根據(jù)已發(fā)表的研究和生物信息學分析,推斷miR-548-a-3p可能是lncRNA TSIX的下游靶標。新興研究表明,miRNA屬于ncRNA,在人類HCC中也起著至關(guān)重要的作用,包括miR-548-a-3p[12]。miR-548-a-3p在肝癌組織和血清中上調(diào),促進細胞生長,與患者預(yù)后不良有關(guān)[13]。lncRNA對miRNA的直接或間接調(diào)節(jié)是發(fā)揮其生物學功能的重要機制之一。生物信息學分析表明,lncRNA TSIX可能通過堿基配對相互作用與miR-548-a-3p結(jié)合,表明它們之間的功能相關(guān)性[14]。與lncRNA TSIX相反,臨床研究觀察到miR-548-a-3p在HCC組織和細胞中顯著增加[15]。有趣的是,在肝癌組織中,lncRNA TSIX的表達與miR-548-a-3p呈顯著負相關(guān),表明它們之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。體外實驗證實,lncRNA TSIX負調(diào)控miR-548-a-3p的表達,這可能取決于直接組合,但具體機制尚待進一步研究。本研究中,lncRNA TSIX mimics組lncRNA TSIX 高于Huh7細胞組,miR-548-a-3p 低于Huh7細胞組(P<0.05);lncRNA TSIX inhibitor組lncRNA TSIX 低于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組,miR-548-a-3p高于Huh7細胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。這說明,lncRNA TSIX的上調(diào)過表達逆轉(zhuǎn)了miR-548-a-3p在體外對HCC細胞的生長促進作用。本文數(shù)據(jù)證明,lncRNA TSIX誘導的HCC生長抑制至少部分由負調(diào)節(jié)miR-548-a-3p介導。
表3 各組Huh7細胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達水平比較
綜上所述,lncRNA TSIX明顯抑制HCC細胞增殖、侵襲,促進HCC細胞凋亡;其機制可能與lncRNA TSIX負調(diào)節(jié)miR-548-a-3p有關(guān)。