閔 江，婁 燕，劉正光，趙才兵，張翠芬，高 鵬，王丹丹，陳 森,梁景樂(lè)

(1. 山東勝利生物工程有限公司 山東濟(jì)寧 272000;2. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 北京 100095)

恩拉霉素 (Enramycin)，又名恩來(lái)霉素、恩霉素、安來(lái)霉素、持久霉素，是由土壤中分離出來(lái)的放線菌 (StreptomycesfungicidiousNO. B5477)發(fā)酵產(chǎn)生的一種多肽類(lèi)抗生素[1-2]。恩拉霉素具有促生長(zhǎng)[3]和改善飼料利用率的作用，并且對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有很強(qiáng)的抑制作用，特別對(duì)腸道中有害的梭菌抑制作用較強(qiáng)，長(zhǎng)期使用后不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，因此被世界上很多國(guó)家推薦作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑，是一種較好的飼料添加劑[4]。

現(xiàn)有的恩拉霉素分離純化方法主要有Amberlite XAD-2 大孔樹(shù)脂[5]、高速逆流色譜[6]、AB-8 大孔樹(shù)脂吸附和分子篩相結(jié)合的方法[7]、大孔樹(shù)脂和反相色譜結(jié)合分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法[8]，提取恩拉霉素方法過(guò)于繁瑣，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。鑒于此，對(duì)恩拉霉素提取工藝進(jìn)行了研究，可為工業(yè)化生產(chǎn)恩拉霉素提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以此填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白。

1 材料與方法

1.1 原料 EN2017184批恩拉霉素發(fā)酵液與恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品由山東勝利生物工程有限公司提供。

1.2 主要試劑 甲醇 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；丙酮 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈 (HPLC，J.T.Baker)；鹽酸 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；活性炭粉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鈉 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 主要儀器 液相色譜儀Agilentl200 (Agilent公司，美國(guó))；FW-100型萬(wàn)能粉碎機(jī)(上海楚定分析儀器有限公司)；JA31002型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限司)；KDM型調(diào)熱電熱套(山東鄄城光明儀器有限公司)；Heidolph 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(海道夫，德國(guó))；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；xutemp型低溫恒溫液浴循環(huán)兩用槽(杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司)；ALPHA1-2型冷干機(jī)(CHRIST)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 恩拉霉素干菌絲體制備 發(fā)酵結(jié)束后，取適量發(fā)酵液，加入2～3%(w/v)硅藻土助濾劑，攪拌均勻，然后用布什漏斗真空抽濾，待發(fā)酵液完全過(guò)濾后，濾餅用3倍發(fā)酵液體積的去離子水洗滌兩次，減壓抽至無(wú)水滴流出，得到的恩拉霉素濕菌絲體，放在真空干燥箱中烘干，粉碎，備用。

1.4.2 恩拉霉素提取工藝 工藝流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 恩拉霉素提取工藝流程圖

1.4.3 恩拉霉素效價(jià)的檢測(cè)

1.4.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取恩拉霉素對(duì)照品適量(約相當(dāng)于恩拉霉素20 mg)，置 100 mL容量瓶中，加稀釋液(2 L丙酮、2.1 L去離子水與18 mL鹽酸混合均勻)適量使溶解，稀釋液稀釋至刻度，制成約含0.2 mg/mL的溶液。

1.4.3.2 供試品溶液的制備 精確稱量恩拉霉素0.02 g，放入100 mL容量瓶中加入適量稀釋液，溶解后用稀釋液定容，搖勻、過(guò)濾、備用。

1.4.3.3 色譜條件[9]用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.6%磷酸二氫鈉溶液(30∶70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 恩拉霉素在不同濃度甲醇溶液中溶解能力 取適量恩拉霉素菌絲體，在30 ℃條件下分別用無(wú)水甲醇、90%甲醇溶液、70%甲醇溶液一次浸提；利用液相色譜檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯觯瑹o(wú)水甲醇浸提恩拉霉素的效果不佳，考慮70%甲醇溶液浸提恩拉霉素菌絲體。

表1 不同濃度甲醇溶液中恩拉霉素溶解度

2.2 浸提pH的選擇 取適量恩拉霉素菌絲體，在30 ℃條件下分別用pH為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的70%甲醇溶液一次浸提；檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，酸性條件下70%甲醇溶液浸提恩拉霉素的效果較好，綜合設(shè)備承受能力與安全因素，確定70%甲醇溶液用稀釋鹽酸至pH為3.5～4.0浸提恩拉霉素菌絲體。

表2 不同pH下70%甲醇溶液中恩拉霉素溶解度

2.3 浸提溫度的選擇 取適量恩拉霉素菌絲體，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃條件下用pH為3.5～4.0的70%甲醇溶液一次浸提；檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出，溫度越高，甲醇溶液浸提恩拉霉素的效果較好。鑒于恩拉霉素穩(wěn)定性較差，綜合動(dòng)力成本與安全因素，確定30 ℃為浸提溫度。

表3 不同溫度下甲醇溶液中恩拉霉素溶解度

2.4 浸提時(shí)間的選擇 取適量恩拉霉素菌絲體，在30 ℃條件下用pH為3.5～4.0的70%甲醇溶液一次浸提；分別在0.5、1、2 h取樣檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表4?？紤]到時(shí)間成本與浸提率，浸提時(shí)間可以選用1 h。

表4 不同時(shí)間下甲醇溶液中恩拉霉素溶解度

2.5 浸提料液比選擇 在30 ℃條件下，比較不同料液比(m/v)對(duì)浸提率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯觯骼顾鼐z體浸提次數(shù)越多，甲醇溶液的使用量越多，浸提率越高，菌渣中殘留的恩拉霉素越少?？紤]到溶劑套用情況、菌渣殘留、生產(chǎn)設(shè)備承受能力等情況，確定一次浸提料液比為1∶7，二次浸提料液比為1∶3，三次浸提料液比為1∶3。

表5 不同料液比對(duì)浸提率的影響

2.6 活性炭用量選擇 濃縮液使用不同活性炭用量(m活性炭v濃縮液)進(jìn)行脫色，考察脫色損失及粗精粉質(zhì)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6?？梢钥闯?，活性炭的使用量越多，粗精粉質(zhì)量越好，但恩拉霉素?fù)p失越多?？紤]到粗精粉需進(jìn)行重結(jié)晶及產(chǎn)品收率問(wèn)題，活性炭用量(m活性炭v濃縮液)可控制在1.0%-1.5%之間。

表6 不同用量活性炭對(duì)恩拉霉素粗精粉質(zhì)量影響

2.7 結(jié)晶次數(shù)的選擇 脫色液加堿結(jié)晶，比較結(jié)晶次數(shù)對(duì)母液中恩拉霉素殘留率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7?？梢钥闯?，兩次結(jié)晶后可較大程度減少母液中殘留的恩拉霉素，提高產(chǎn)品收率。

表7 結(jié)晶次數(shù)對(duì)產(chǎn)品收率的影響

2.8 重結(jié)晶工藝選擇 恩拉霉素粗精粉含量在85%左右，嘗試使用70%甲醇溶液、乙酸乙酯、丙酮溶液等對(duì)粗精粉進(jìn)行重結(jié)晶純化，50%丙酮溶液重結(jié)晶效果較好，獲得恩拉霉素純品顏色較白，含量97%以上，丙酮溶液中殘留較多恩拉霉素，收率偏低，下一步實(shí)驗(yàn)擬提高此工藝過(guò)程的收率。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)浸提溶劑、浸提pH、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比、活性炭用量等單因素研究，確定了恩拉霉素提取的最佳工藝：浸提溶劑為70%甲醇溶液，浸提pH為3.5～4.0，浸提溫度為30 ℃；三次浸提時(shí)間都為1 h；一次浸提料液比為1∶7，二次浸提料液比為1∶3，三次浸提料液比為1∶3；活性炭用量(m活性炭v濃縮液)為 1.0%～1.5%；兩次結(jié)晶獲得粗精粉，并對(duì)粗精粉進(jìn)行重結(jié)晶，可獲得含量高達(dá)97%的恩拉霉素純品。相比較現(xiàn)有的大孔樹(shù)脂吸附及色譜等恩拉霉素的分離純化方法，此工藝的操作簡(jiǎn)單易行，對(duì)設(shè)備要求較低，另外此工藝穩(wěn)定可行，所用的溶劑均可回收利用，對(duì)環(huán)境污染較小，為工業(yè)化生產(chǎn)恩拉霉素純品奠定基礎(chǔ)。