陸彥蓉，楊婭林，殷曉陽，李華明，彭大鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，湖北 武漢 430070)

近年，隨著科技水平的提升，納米粒子憑借其小尺寸、高比表面積和高反應(yīng)活性等性質(zhì)成為了獸藥殘留檢測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，磁性納米粒子(Magnetic nanoparticles, MNPs)便是其中非常重要的一種，具有超順磁性和磁導(dǎo)向性的同時又具有超高的生物相容性。MNPs與免疫技術(shù)、分子印跡技術(shù)及傳感器技術(shù)等結(jié)合，或用作固定生物分子的載體，或用作信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和增強(qiáng)的電活性、光學(xué)標(biāo)記，在生物醫(yī)學(xué)、食品安全以及農(nóng)獸藥殘留檢測等研究領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛力和商業(yè)前景。

1 磁性納米材料的概述

磁性納米材料主要包括粒徑小于100 nm的金屬(鐵、鎳、鈷)及其氧化物和合金等，鐵礦物或磁性鐵氧化物較鎳、鈷毒性低，為了保護(hù)人們的健康以及生態(tài)環(huán)境，目前更常用鐵礦物或磁性鐵氧化物制備MNPs。其中，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子磁學(xué)和化學(xué)性能突出，是各研究領(lǐng)域首選的磁性材料之一，目前其合成方法主要有共沉淀法、溶劑熱法、熱分解法以及微乳液法等，但是這些合成方法都存在各自的缺點(diǎn)?；瘜W(xué)共沉淀法易使金屬離子不均勻沉淀，原料團(tuán)聚，制備分布間距較小的MNPs反應(yīng)條件極嚴(yán)格。溶劑熱法存在耗時長，條件相對苛刻且產(chǎn)量有限等缺點(diǎn)[1]，熱分解法制備的MNPs親水性弱，生物相容性較差，試劑消耗種類多，成本較高[2]。微乳液法產(chǎn)量低、有機(jī)試劑用量大，不適用于批量生產(chǎn)，剩余的表面活性劑可能會對MNPs的性質(zhì)產(chǎn)生影響[3]。

此外，MNPs因比表面積較大，表面能高以及磁偶極的相互作用等特點(diǎn)而易發(fā)生團(tuán)聚、氧化，導(dǎo)致其原有的性質(zhì)和性能發(fā)生改變?，F(xiàn)有研究表明，在MNPs表面修飾上合適的功能基團(tuán)，對其性能進(jìn)行優(yōu)化，一定程度上可解決MNPs易氧化團(tuán)聚等問題。

如表1所示，科研人員可以直接或者利用化學(xué)反應(yīng)將殼聚糖、淀粉、聚乙烯醇等高分子聚合物包裹在MNPs的表面，使其保持良好的生物相容性；或是利用活性炭、碳納米管、石墨烯等碳材料自身的性質(zhì)改善納米顆粒的團(tuán)聚現(xiàn)象，防止MNPs氧化腐蝕并提高其吸附性能；此外，還可通過溶膠-凝膠反應(yīng)將二氧化硅等無機(jī)氧化物包覆在MNPs表面，增強(qiáng)其耐酸性和分散性，充分發(fā)揮磁性納米材料的優(yōu)點(diǎn)。

表1 功能化磁性納米粒子的應(yīng)用

2 磁性納米材料在樣品前處理的應(yīng)用

2.1 磁固相萃取 磁固相萃取(magnetic solid phase extraction, MSPE)是一種利用磁性材料或可磁化的材料作為吸附劑進(jìn)行樣本前處理的一種新型方法(表2)。磁性吸附劑直接加入到含待測物的樣品溶液中將其吸附至表面，在外部磁場作用下，使吸附有待測物的磁性吸附劑與其他組分分離后再利用洗脫液洗脫下待測物，最后借助外部磁場分離吸附劑與洗脫組分。在復(fù)雜基質(zhì)的分離和凈化中，磁性材料是最理想的吸附材料之一。

表2 磁固相萃取在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

如表2所示，相對于與傳統(tǒng)的樣品前處理方法，MSPE可以簡單高效地實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中痕量獸藥殘留的萃取，與高效液相檢測儀、膠體金試紙條等結(jié)合使用可對獸藥殘留實現(xiàn)高靈敏度的檢測。Xin He等[9]將磁性石墨烯作為提取牛乳、雞肉以及雞蛋中氟喹諾酮類藥物的新型吸附劑，然后再結(jié)合高效液相色譜法檢測其殘留量，檢測限為0.05～0.3 μg/kg，加標(biāo)樣品的回收率為82.4～108.5%。這種提取方法顯示出對7種氟喹諾酮類藥物的高吸收能力(>6800納克)和高富集因子(68～79倍)。此外，這種吸收劑可以重復(fù)使用至少40次。結(jié)果表明，該方法具有高吸收容量、高回收率、高富集效果、高靈敏度、滿意的純化效果和良好的重復(fù)使用性。Kesheng Wu等[11]采用微乳液法合成了新型磺化聚苯乙烯磁性納米球，并用于預(yù)濃縮豬肉中的克倫特羅，與膠體金免疫層析測定法相結(jié)合檢測豬肉中的克倫特羅殘留，并通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜證實了其結(jié)果。此外，相較于克倫特羅傳統(tǒng)的樣品前處理方法，提取時間縮短了3倍。Jianme Wang等[14]利用選擇性加速溶劑萃取法對畜禽糞便樣品進(jìn)行初步純化后利用MSPE提高純化效果，在最佳條件下對樣品中的33種抗生素進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，加標(biāo)回收率為60.3%～110.0%，檢出限為0.2～3.5 μg/kg。此外，研究中還利用在30個養(yǎng)殖場所采集的畜禽糞便對新建立的方法進(jìn)行測試，并證實了其在實際樣品中的檢測獸藥殘留的可行性。

雖然目前已有商品化磁性吸附劑，但成本較高，另外MSPE發(fā)展時間較短，技術(shù)不夠成熟，萃取效果易受萃取、洗脫試劑的種類，反應(yīng)時間以及樣品溶液的體積、pH值等諸多因素的影響，萃取性能也會隨時間下降。

2.2 磁性分子印跡技術(shù) 磁性分子印跡技術(shù)將磁分離與分子印跡結(jié)合，首先使模板分子(目標(biāo)分子)、功能單體與交聯(lián)劑共同反應(yīng)，將功能基團(tuán)固定在聚合物的剛性結(jié)構(gòu)里，模板分子經(jīng)洗脫后形成具有可特異性識別目標(biāo)分子的固定孔穴結(jié)構(gòu)的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)，最后將其偶聯(lián)在磁性材料周圍，便可制備出磁性分子印跡聚合物 (magnetic molecularly imprinted polymers, MMIPs)。

如表3所示，基于MIPs的磁性識別程序為從非常復(fù)雜的基質(zhì)和生物樣品中提取獸藥殘留物質(zhì)帶來了高靈敏度和高選擇性，MMIPs既保留了MIPs與目標(biāo)分子特異性高效偶聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)，同時又改善了MIPs較難與樣品基質(zhì)分離的問題，簡化了離心、過濾等操作。Yuxia Huang等[15]分別采用本體聚合法和溶膠-凝膠法制備了兩種MMIPs對牛奶中己烯雌酚進(jìn)行提取，并結(jié)合高效液相色譜法對其進(jìn)行檢測，兩種方法的檢出限均為2.0 μg/L，回收率分別為88.3%～97.6%和90.5%～103.5%，MMIPs的吸附容量是磁性分子非印跡聚合物的1.78倍，具有較高的精密度和靈敏度，且前處理簡單。Kunsa-Ngiem等[17]基于微波加熱誘導(dǎo)聚合和乙烯基功能化Fe3O4合成了新的MMIP，為提取雞飼料中氯霉素提供了一種新的方法，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合檢測限可達(dá)0.12 μg/kg，與以往的研究相比，檢測限更低，樣品處理更簡單，此外，MMIP可至少重復(fù)使用5次。因此，MMIP是一種很有前途的復(fù)雜動物源性食品檢測方法。

表3 磁性分子印跡聚合物在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

但是目前磁性分子印跡技術(shù)也存在一些問題，MMIPs的制備方法具有局限性，實際應(yīng)用中缺少合適的功能單體、交聯(lián)劑；合成分子印跡物時未能將模板洗脫干凈，在檢測低濃度甚至痕量待測物時存在模板泄露，引入較大誤差；相對于其他磁固相萃取吸附劑重復(fù)使用次數(shù)較少。

3 磁性納米材料在獸藥殘留檢測中的研究進(jìn)展

3.1 磁免疫層析試紙條 磁免疫層析技術(shù)是利用表面修飾有抗體的功能化MNPs作為標(biāo)記物，與含有相應(yīng)抗原的待測物特異性結(jié)合，通過肉眼觀察標(biāo)記物顏色，或在外加磁場條件下測定被富集的MNPs磁信號對待測物進(jìn)行殘留檢測的免疫分析方法。

閆靈芝[21]呋喃唑酮代謝物的衍生物為目標(biāo)分析物，以膠體金和磁性材料為標(biāo)記材料建立了兩種免疫層析試紙條，目測觀察的檢測限分別為1 μg/L和0.5 μg/L，實驗結(jié)果表明，抗體通過化學(xué)鍵與磁珠偶聯(lián)，較膠體金、乳膠顆粒等的物理吸附更穩(wěn)定，形成的免疫磁珠響應(yīng)性無明顯變化，分散性良好，標(biāo)記過程中可使用磁分離，較離心更加簡便。此外，磁免疫層析試紙條的特異性良好，與其他類抗生素不存在交叉反應(yīng)，而且MNPs的使用提高了檢測的靈敏度。黃薇[23]對8種不同來源的MNPs進(jìn)行了性能對比，篩選出兩種可用于免疫層析試紙條的磁珠，并考察了不同鹽濃度以及pH對二者性能的影響，最后成功建立了檢測氯霉素的磁免疫層析試紙條，檢測限可達(dá)4 μg/L以下。相對于傳統(tǒng)膠體金試紙條的光學(xué)信號，磁信號可貫穿NC膜，不會受外界光反射、折射等干擾，生物樣品也幾乎不表現(xiàn)磁性，生物背景干擾小，因而磁免疫層析試紙條有更高的靈敏度，但是我國對于其的研究仍處于初步階段，如表4所示，有關(guān)獸藥殘留檢測的研究屈指可數(shù)，市場上也未有商品化的磁免疫層析試紙條。

表4 磁免疫層析在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

目前阻礙磁免疫層析試紙條發(fā)展的原因可能是磁珠合成方法不如膠體金簡單、成熟，可用于免疫層析試紙條的商品化磁珠較少，價格昂貴；其次，磁珠偶聯(lián)抗體的方法較膠體金標(biāo)記抗體更為復(fù)雜嚴(yán)格；另外，磁信號檢測儀較昂貴、便攜式的小型檢測儀還未普及，不適用于一般的養(yǎng)殖戶。

3.2 磁生物傳感器 生物傳感器是指以酶、抗體、細(xì)胞等為代表的生物活性單元作為敏感原件去識別待測目標(biāo)物，將生物學(xué)信號轉(zhuǎn)換成人們可以理解的光學(xué)、電化學(xué)、磁學(xué)等信號的分析工具或系統(tǒng)。

目前，磁性材料正朝著多功能材料的方向發(fā)展，可基于其超順磁性、大比表面積、酶活性以及磁/光/電特性等單獨(dú)或者同時參與生物傳感器的樣品富集和分離、信號讀出以及檢測信號放大等過程，在生物傳感器領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

磁性材料在生物傳感器中的應(yīng)用過去大多僅作為分離探針富集待測物，檢測結(jié)果時再更換成電化學(xué)或者熒光等其他信號分子，這樣的轉(zhuǎn)換會增加檢測步驟的復(fù)雜性，而近年磁生物傳感器逐漸將磁分離和磁信號的分析結(jié)合為一體，如表5所示，磁弛豫開關(guān)生物傳感器(MRS)便是其中最經(jīng)典的例子之一。Yongzhen Dong等[24]以負(fù)載Gd3+的磁性納米粒子作為探針，通過整合磁分離和磁弛豫開關(guān)開發(fā)了一種多價磁性生物傳感器。作為一種過渡金屬離子，Gd3+在d軌道上有多個不成對的電子，可以感應(yīng)出一個強(qiáng)的波動磁場，因此可以減少橫向弛豫時間(T2)產(chǎn)生一個強(qiáng)磁信號，能夠在0.1～100 ng/mL的線性范圍內(nèi)檢測萊克多巴胺，檢測限為20 pg/mL，與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗相比，靈敏度提高了25倍。Zhilong Wang等[25]報道了一種依賴于錳(ⅶ)/錳(ⅱ)相互轉(zhuǎn)換和橫向弛豫速率(R2)的低場核磁共振相應(yīng)變化的磁性免疫傳感器，能夠以高靈敏度檢測PBS和豬尿樣品中的萊克多巴胺，檢測限可達(dá)8.1 pg/mL。與使用其他順磁離子如鐵(ⅲ)/鐵(ⅱ)或銅(ⅱ)/銅(ⅰ)的磁傳感器相比，錳(ⅶ)沒有磁信號，而錳(ⅱ)具有強(qiáng)磁信號，基于錳(ⅶ)/錳(ⅱ)相互轉(zhuǎn)化的方法的不僅可以開發(fā)具有高信號背景比的無背景磁性免疫傳感器，靈敏度也更高。這種錳介導(dǎo)的磁性免疫傳感器不僅保持了良好的穩(wěn)定性，而且大大提高了傳統(tǒng)順磁離子介導(dǎo)的磁性傳感器的靈敏度，為靈敏、穩(wěn)定和方便的生物分析提供了一個有前途的平臺。

表5 磁生物傳感器在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

但是，待測物結(jié)合前后的粒徑、表面結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量、MNPs或待測物的濃度等對MRS的檢測結(jié)果都有較大的影響，在檢測獸藥殘留小分子時，獸藥小分子通常只有1個可以和抗體特異性結(jié)合的位點(diǎn)，磁信號變化微弱，導(dǎo)致傳統(tǒng)MRS靈敏度無法對小分子目標(biāo)物實現(xiàn)痕量檢測。此外，這種電磁傳感技術(shù)目前也無法進(jìn)行高通量分析。

4 展 望

近年，隨著人們對納米材料興趣的加深，磁性納米材料與獸藥殘留檢測技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用也逐漸廣泛，但是目前主要應(yīng)用于樣品前處理，與免疫層析、傳感技術(shù)等結(jié)合作為信號探針使用的研究尚在初步階段，而且MNPs易團(tuán)聚、氧化，性質(zhì)不夠穩(wěn)定，商品化磁珠較少且價格昂貴，另外磁信號檢測儀的來源主要依賴進(jìn)口。針對以上問題，未來的研究內(nèi)容和方向可參考以下幾點(diǎn)：繼續(xù)改進(jìn)MNPs的合成和修飾方法，尋找平價原料或簡化合成步驟，制備更加穩(wěn)定的功能化MNPs的同時降低成本；將MNPs與檢測技術(shù)更好的結(jié)合，一步實現(xiàn)樣品處理和目標(biāo)物分析；注重與其他交叉學(xué)科的融合，推動檢測儀器的智能化和便攜化，共同促進(jìn)獸藥殘留檢測技術(shù)的發(fā)展。