盧 迪，羿 巖，趙寶凱，耿 健，那 璐，閆 琰

(沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司，沈陽 110027)

泰萬菌素是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]，由英國伊科拜克動物保健品有限公司開發(fā)，常使用其酒石酸鹽。2004年9月9日經(jīng)歐盟批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療由豬肺炎支原體[2]引起的豬氣喘病、由豬痢疾短螺旋體引起的豬痢疾、由胞內(nèi)勞森氏菌引起的豬增生性腸炎和由雞毒支原體引起的雞支氣管感染[3]。目前國內(nèi)已批準(zhǔn)酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑和可溶性粉用于治療豬、雞支氣管感染和豬血痢短螺旋體以及其他敏感細(xì)菌的感染[4]。泰萬菌素具有高效、低毒、低殘留，能夠殺滅革蘭氏陽性菌等作用，具有良好的研發(fā)和應(yīng)用前景[5]。本試驗研究酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑在仔豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征[6]，并將其作為受試制劑與國際市場上的主流產(chǎn)品進行對比分析，以期為新藥研發(fā)和臨床用藥提供科學(xué)指導(dǎo)[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑標(biāo)準(zhǔn)品[8](批號：K0691908)，中國藥品生物制品檢定所；酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑(規(guī)格：100 g：20 g, 批號：2131301)由沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑(規(guī)格：100 g：20 g, 批號：2111601)由英國伊科拜克動物保健品有限公司生產(chǎn)[9]，非那雄胺標(biāo)準(zhǔn)品(批號：Y0000090)，中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要儀器 Exion LC AD Pump，Exion LC AD Solvent Valve，Exion LC AD Degasser，Exion LC AD Controller，Exion LC AD AC Column Oven，Triple Quad 4500MD四級桿質(zhì)譜儀，Analyst?1.6.3質(zhì)譜工作站，(美國AB SCIEX公司)；QUINTIX125D電子精密天平(Sartorius公司)；微型旋渦混合儀(DLAB公司)；H2050R高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；超低溫冰箱(中科美菱)；SG8200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；20、50、100、200、1000 μL移液器(Eppendorf公司)。

1.1.3 主要試劑 甲醇、甲酸、乙腈色譜級購自Sigma-Aldrich公司；純凈水、蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.1.4 試驗動物 健康一元大白豬12頭，28日齡，(公豬)，試驗前采用耳標(biāo)標(biāo)記，編號為：1～12號，平均體重為：7.96±0.5 kg，購自遼寧偉嘉農(nóng)牧生態(tài)食品有限公司種豬場。試驗前正常飼養(yǎng)觀察1周，每天定時飼喂三次，飼喂不含任何藥物的全價日糧(沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司提供)。

1.1.5 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的配制：精密稱取酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇中，得到濃度為1.00 mg/mL的儲備液，密封后在-20 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液的配制：用純甲醇稀釋儲備液成下列酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑系列溶液。標(biāo)曲系列溶液濃度：C1：20000 ng/mL，C2：10000 ng/mL，C3：4000 ng/mL，C4：2000 ng/mL，C5：1000 ng/mL，C6：400 ng/mL，C7：200 ng/mL，C8：100 ng/mL；質(zhì)控系列溶液濃度：HQC：16000 ng/mL，MQC：3000 ng/mL，LQC：300 ng/mL。內(nèi)標(biāo)品(IS)溶液的配制：精密稱取非那雄胺標(biāo)準(zhǔn)品分別溶甲醇中，得到濃度分別為1.00 mg/mL的儲備液，密封后在-20 ℃度保存，取內(nèi)標(biāo)儲備液用純甲醇稀釋成40 ng/mL非那雄胺甲醇溶液，用于樣品預(yù)處理。

1.2 方法

1.2.1 藥物動力學(xué)試驗設(shè)計[10]所有仔豬給藥前禁食12 h，給藥6 h后恢復(fù)正常飲食，對每頭仔豬進行稱重，并采集血樣作為空白對照組。將試驗仔豬隨機分為兩組，每組6頭，第一組編號為1～6號，口服灌喂沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司的酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑；第二組編號為7～12號，口服灌喂英國伊科拜克動物保健品有限公司的酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑，給藥劑量均為125 mg/kg[11]?？诜o藥后，每頭仔豬于0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h前腔靜脈采血1 mL左右[12]，所采血液均含有抗凝劑肝素鈉的試管中室溫下靜置2 h后3000 r/min離心8 min，分離血漿，取上清液于-20 ℃冷凍保存，待測定[13]。

1.2.2 色譜條件 進樣器溫度：4 ℃ ,柱溫：室溫，色譜柱： 納譜科技C18 3 μm，3.0×50 mm 進樣體積：10 μL，流速：0.6 mL/min,流動相A：含有0.1%(V/V)甲酸的水溶液，流動相B：含有0.1%(V/V)甲酸的甲醇溶液(表1)。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式檢測(POS)，源參數(shù)：CUR(氣簾氣):35.00 psi；IS(離子化電壓):5500.00 V；TEM(溫度):600.00 ℃；GS1(噴霧氣):50.00 psi；GS2(輔助加熱氣):50.00 psi；CAD(碰撞氣):7.00 psi；EP(攝入電壓):10.00 V；CXP(碰撞室射出電壓):6.00 V(表2)。

表2 定量離子對

1.2.4 生物樣品的處理 取50 μL樣品于干凈的1.5 mL EP管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)(40 ng/mL 非那雄胺甲醇溶液)溶液混勻后，沉淀蛋白，渦旋1 min，15000 r/min離心5 min，取上清液100 μL轉(zhuǎn)移至96孔深孔板，加入300 μL水，渦旋混勻。密封，上機測定。

1.2.5 血漿樣品的處理 將血漿樣品從-20 ℃冰箱中取出，室溫下自然解凍，取10 μL質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品溶液于干凈的1.5 mL EP管中，加入190 μL空白豬血漿，混勻后，制備成濃度分別為15、150、800 ng/mL的質(zhì)控的血漿。分別取50 μL樣品于干凈的1.5 mL EP管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)(40 ng/mL 非那雄胺甲醇溶液)溶液混勻后，沉淀蛋白，渦旋1 min，15000 r/min離心5 min，取上清液100 μL轉(zhuǎn)移至96孔深孔板，加入300 μL水，渦旋混勻，密封，上機測定。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液于干凈的1.5 mL EP管中，加入190 μL空白豬血漿，混勻后，制備成濃度分別為5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線的血漿。分別取50 μL樣品于干凈的1.5 mL EP管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)(40 ng/mL 非那雄胺甲醇溶液)溶液混勻后，沉淀蛋白，渦旋1 min，15000 r/min離心5 min，取上清液100 μL轉(zhuǎn)移至96孔深孔板，加入300 μL水，渦旋混勻。密封，上機測定。

1.2.7 樣品的質(zhì)量控制 樣品的質(zhì)量控制應(yīng)符合生物分析規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)：質(zhì)控樣品每一濃度水平至少>50%以上。

1.2.8 豬血漿中藥物濃度測定 將給藥后不同時間點獲取的血漿，按血漿樣品的處理方法處理后進行上機測定數(shù)據(jù)采集采用Analyst?1.6.3軟件；同一序列采集的色譜圖使用相同的積分事件進行處理，樣品計算峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出血漿中樣品濃度，對濃度值(待測物與內(nèi)標(biāo)濃度的比值)和響應(yīng)值(待測物與內(nèi)標(biāo)濃度的比值)進行線性回歸(Y=ax+b)，權(quán)重因子W=1/X2。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件分析處理方法學(xué)數(shù)據(jù)并繪制血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及藥-時曲線圖；藥代動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算采用DAS 2.1.1 藥物動力學(xué)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的確證 在本研究所建立的方法下，樣品保留時間為1.63 min，峰形對稱性良好，基線平穩(wěn)，無明顯干擾峰，檢測效率高?？瞻籽獫{色譜圖如圖1，空白血漿中添加樣品色譜圖如圖2，給藥后血漿中樣品色譜圖如圖3。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 空白血漿中添加泰萬菌素(ng/mL)色譜圖

圖3 給藥后血漿中泰萬菌素(ng/mL)色譜圖

2.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及數(shù)據(jù)表 標(biāo)準(zhǔn)曲線符合以下生物分析規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)：校正標(biāo)樣各濃度點的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±15%以內(nèi)，定量下限處應(yīng)該在±20%以內(nèi)。至少75%且至少6個濃度的校正標(biāo)樣，應(yīng)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)系數(shù)R值應(yīng)不小于0.99(表3、圖4)。

表3 泰萬菌素典型回歸曲線數(shù)據(jù)

圖4 泰萬菌素在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品的質(zhì)量控制 根據(jù)表4的質(zhì)控數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，質(zhì)控樣品的每一濃度水平都在50%以上，符合規(guī)定。

表4 泰萬菌素典型質(zhì)控數(shù)據(jù)

2.4 藥代動力學(xué)試驗結(jié)果 口服酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑血藥濃度-時間見表5；口服英國伊科拜克動物保健品有限公司的酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑血藥濃度-時間見表6；兩組藥代動力學(xué)參數(shù)見表7，兩組藥-時曲線見圖5。

表5 口服酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑隨時間變化的血藥濃度(ng/mL)

表6 口服英國伊科拜克動物保健品有限公司酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑隨時間變化的血藥濃度(ng/mL)

表7 藥代動力學(xué)參數(shù)

圖5 口服酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑藥-時曲線

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件 據(jù)朱曉娟等報道[14]，目前泰萬菌素血藥濃度測定法常用高效液相色譜法(HPLC)，此方法存在樣品處理時間長，靈敏度相對低，線性范圍窄等缺點。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜法[15]建立了仔豬血漿中泰萬菌素的定量分析方法，該方法能縮短樣品處理時間，操作方便，靈敏度高，線性范圍寬，回收率高且雜質(zhì)峰少，流動相A采用含有0.1%(V/V)甲酸的水溶液，流動相B采用含有0.1%(V/V)甲酸的甲醇溶液，樣品出峰時間穩(wěn)定，峰形尖銳，與血漿中其余雜質(zhì)完全分離，對于樣品中代謝范圍大的代謝化合物能達(dá)到很好的檢測效果，可應(yīng)用于泰萬菌素在豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究。

3.2 樣品處理 為保證血漿樣品處理的準(zhǔn)確性，本研究采用了40 ng/mL 非那雄胺甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備成濃度分別為15、150、800 ng/mL的血漿，充分沉淀血漿中的蛋白雜質(zhì)，保證樣品提取回收率，有效的提高了檢測方法的準(zhǔn)確度，減少試驗誤差保證數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。

3.3 藥代動力學(xué)特征 本研究用DAS 2.1.1 藥動學(xué)軟件處理兩組藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，口服沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司的酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑在仔豬體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)如下：平均最高血藥濃度(Cmax)為247.3 ng/mL，平均藥時曲線下面積(AUC)為1899.0 ng/mL·h,平均達(dá)峰時間(Tmax)為1 h；口服英國伊科拜克動物保健品有限公司的酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑主要藥動學(xué)參數(shù)如下：平均最高血藥濃度(Cmax)為159.8 ng/mL，平均藥時曲線下面積(AUC)為986.0 ng/mL·h,平均達(dá)峰時間(Tmax)為1.5 h；沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司的酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑平均最高血藥濃度(Cmax)是參比制劑的1.55倍，平均藥時曲線下面積(AUC)是參比制劑的1.93倍，生物利用度是參比制劑的193%。

3.4 科學(xué)用藥 目前養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)模式的總體發(fā)展方向是健康安全養(yǎng)殖，根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告[16]，減抗、限抗將成為養(yǎng)殖新常態(tài)。歐洲飼料限抗后對養(yǎng)殖的生產(chǎn)性能影響較大，以豬為例，平均日增重下降，死亡率增加，斷奶日齡延遲，現(xiàn)場處方用藥的年用量不斷增加。當(dāng)前中國的養(yǎng)殖模式下，斷奶仔豬腹瀉、保育豬免疫抑制疾病繼發(fā)細(xì)菌感染、育肥豬常見呼吸道與腸道感染以及母豬的產(chǎn)前產(chǎn)后的各種混合感染是養(yǎng)殖過程的主要疾病，過去，飼料中抗菌促生長的藥物廣泛應(yīng)用，有效的控制了細(xì)菌的定植和增殖，現(xiàn)在，進入健康養(yǎng)殖新時代，其養(yǎng)殖用藥的主要原則為科學(xué)合理用藥與精準(zhǔn)用藥。養(yǎng)殖過程中不能過度用藥，要減少用量，健康養(yǎng)殖是養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展趨勢，健康養(yǎng)殖不是無抗養(yǎng)殖而是科學(xué)合理的選擇使用獸用抗菌藥[17]。泰萬菌素是3代大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗生素[18]，通過一種耐熱鏈球菌轉(zhuǎn)化將泰樂菌素第3位進行乙?；偷?位進行異戊酰化而獲得，對支原體、螺旋體、大部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌均有較強抗菌活性，泰萬菌素已被多項研究證實可抑制PRRSV(豬藍(lán)耳病病毒)的復(fù)制，為新一代的獸用抗病毒藥物[19]。針對性提高諸如泰萬菌素等高端抗生素生物利用度的制劑工藝研發(fā)，用以提高藥物安全性，加快抗生素的吸收和代謝速度，縮短藥物殘留時間和休藥期，對于健康養(yǎng)殖具有重要意義。平穩(wěn)的血藥濃度，降低波峰波谷現(xiàn)象[20]已成為行業(yè)趨向性需求。酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑在仔豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究結(jié)果將對其新獸藥研發(fā)和臨床使用提供重要參考[21]。