唐成林 林 昶 楊 菁 張雪麗 馬蕭蕭

1.貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站,貴州 貴陽 550001；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550025

魔芋又名蒟蒻、鬼芋、蛇六谷、花傘把等[1-2]，為天南星科植物魔芋(AmorphophalluskonjacC.Koch) 的新鮮或干燥塊莖。秋、冬兩季采挖，除去雜質(zhì)，洗凈，鮮用或陰干。主要功效為解毒消腫，化痰散結(jié)，化瘀，用于治療癰腫風(fēng)毒、疔瘡、瘧疾、蛇蟲咬傷、跌打損傷等[3-5]。目前在抗腫瘤方面研究較多，對(duì)胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌及惡性淋巴瘤等惡性腫瘤有一定抑制效果[6-7]。其主要成分為魔芋葡甘聚糖，含量高達(dá)50%以上，此外還含蛋白質(zhì)、少量生物堿、黃酮類、氨基酸、揮發(fā)油及微量元素等[8-9]。

魔芋作為藥用在上海、天津、浙江等地的中藥材標(biāo)準(zhǔn)上均有記錄，如楊柳等[2,10]對(duì)魔芋進(jìn)行研究時(shí)，記述其在《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1994年)[11]中記作“蛇六谷”，重點(diǎn)描述其性狀及功能主治，《浙江藥用植物志》(1980年)中[12]，除外觀性狀描述還有化學(xué)成分及生境等記載；《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2011年版)[13]也有記載，并對(duì)其水分、灰分、浸出物做出限量控制?！顿F州中草藥資源研究》(2007年)[14]、《貴陽市中草藥資源》(2005年)[15]、《黔本草》(2015年)[16]中記載魔芋在貴州作為布依族、苗族等少數(shù)民族習(xí)用藥，使用廣泛，且目前在貴州畢節(jié)(七星關(guān)區(qū)、威寧縣、金沙縣)、遵義市(務(wù)川縣、桐梓縣、湄潭縣)、六盤水市、興義市、黔東南雷山縣等地[17]，均已出現(xiàn)規(guī)?；N植，其開發(fā)利用價(jià)值顯著。

現(xiàn)有的各地方標(biāo)準(zhǔn)收載內(nèi)容略有差異，大部分僅限于性狀鑒別，少數(shù)涉及理化鑒別，在成分含量控制及主要指標(biāo)成分的控制方面有所欠缺，本實(shí)驗(yàn)建立了魔芋飲片性狀、顯微及薄層鑒別；對(duì)水分、總灰分、浸出物項(xiàng)進(jìn)行初步控制，建立魔芋UV含量測(cè)定方法，為魔芋藥材的基礎(chǔ)研究、內(nèi)在成分質(zhì)量控制奠定一定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；BX53生物顯微鏡(日本01 ympus公司)；800型離心機(jī)(上海銳騰機(jī)械廠)；OSB-2200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；YQ-1000A超聲控制儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；ME204E/02型萬分之一電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；AUW220D型十萬分之一分析天平(蘇州島津儀器有限公司)；UV-5900紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

1.2 材料 硅膠G薄層板(批號(hào):20171203，青島海洋化工廠分廠)。D-無水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：GZDD-0171，貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司)。稀甘油、水合氯醛試液、乙醇、氯仿、正丁醇、冰醋酸、磷酸、濃硫酸、苯酚、對(duì)氨基苯甲酸、氫氧化鈉等均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用10批魔芋樣品均采集自貴州不同地區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥實(shí)驗(yàn)室孫慶文教授鑒定為：天南星科魔芋屬多年生草本植物魔芋(AmorphophalluskonjacC.Koch)的球狀塊莖，具體采集地及批號(hào)見表1。

表1 不同批次藥材產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品為橫切或縱切的不規(guī)則片狀，大小不一，厚1～2 mm，外皮灰黑色或灰褐色，切面灰白色或灰褐色，表面粗糙，有多數(shù)顆粒狀突起，質(zhì)脆，斷面灰白色或灰褐色，略顯顆粒狀。氣微，味辛，略麻舌，如圖1所示。

圖1 魔芋飲片性狀特征圖

2.2 顯微鑒別 本品粉末類白色至淡棕色。10批魔芋藥材粉末于顯微鏡下觀察，總結(jié)如下(如圖2所示)：淀粉粒極多，單粒型呈類球形或長圓形，臍點(diǎn)呈點(diǎn)狀、星狀、裂縫狀；復(fù)粒淀粉由2～16個(gè)分粒積聚而成；草酸鈣針晶多見，散在分布或成束分布于薄壁細(xì)胞中；草酸鈣簇晶亦較多，多散在分布，導(dǎo)管多為環(huán)紋及螺紋導(dǎo)管；木栓化細(xì)胞淡棕色，表面觀呈不規(guī)則多角形；粘液細(xì)胞圓形或橢圓形。

1. 淀粉粒；2.草酸鈣針晶；3.草酸鈣簇晶；4.導(dǎo)管；5.粘液細(xì)胞；6.木栓細(xì)胞圖2 魔芋粉末顯微特征圖

2.3 薄層鑒別 取本品粉末1 g，加400 mL去離子水溶脹24 h，抽濾，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，減壓濃縮至25 mL左右，按一定比例加Sevag試劑除蛋白[18]，震蕩20 min，離心，重復(fù)5～7次，分離出的葡甘聚糖水溶液，依次加70%、80%、95%、100%乙醇沉降，4 ℃靜置過夜，抽濾，沉淀以適量無水乙醇洗滌3次，45 ℃烘干，得到的葡甘聚糖，加去離子水3 mL溶脹，過夜，30 ℃水浴溶脹1 h，離心，取上清液2.0 mL于10mL比色管中，進(jìn)行酸水解，操作按文獻(xiàn)[18]，水解完成后， 60 ℃ 減壓至溶劑完全揮發(fā)，用70%乙醇2 mL溶解，進(jìn)行離心(3000 r/min，10 min)取上清液為供試品溶液。另取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，以相同溶劑制成每1毫升含0.1 mg的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)[19]，分別吸取供試品、對(duì)照品溶液各1μL，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(2∶1∶1)為展開劑[20]，上行展開，取出，晾干后，均勻噴對(duì)氨基苯甲酸溶液[21]，烘箱105 ℃加熱約10 min，于紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果如圖3所示。

1.葡萄糖對(duì)照品；2.20160713；3.20160823；4.20150916；5.20160909；6.20160911；7.20160813；8.20171127；9.20171127；10.20171215；11.20171226圖3 不同批次魔芋飲片薄層色譜圖

2.4 檢查

2.4.1 水分 按《中國藥典》2020年版通則0832第二法[22]，測(cè)定并計(jì)算10批魔芋的水分含量(%)，平行操作2次，取平均值作為結(jié)果，結(jié)果：10批魔芋的水分為11.95%～13.52%，平均值12.65%，暫定水分不超過15.0%。樣品測(cè)定結(jié)果見表3。

表2 浸出物測(cè)定結(jié)果 (%)

2.4.2 總灰分 按《中國藥典》2020年版通則2302總灰分測(cè)定法[23]，測(cè)定并計(jì)算10批魔芋的總灰分含量(%)，平行操作2次，取平均值作為結(jié)果，結(jié)果：10批魔芋的總灰分為2.87%～6.77%，平均值5.02%，暫定總灰分不超過6.1 %。樣品測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同批次飲片水分、灰分及浸出物測(cè)定結(jié)果

2.5 浸出物 按《中國藥典》2020年版通則2201浸出物測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定[24]，考察水及不同濃度乙醇(30%、50%、70%、無水乙醇)為溶劑，熱浸法和冷浸法分別測(cè)定浸出物，平行操作兩次，取平均值作為結(jié)果。溶劑及方法選擇依據(jù)見表2；結(jié)果浸出物條件考察試驗(yàn)中，以熱浸法50%乙醇為溶劑，浸出物含量相對(duì)最高，10批魔芋的浸出物為12.24%～16.94%，平均值14.93%，暫定浸出物含量不少于12.0 %。測(cè)定結(jié)果見表3。

2.6 總多糖含量測(cè)定

2.6.1 對(duì)照品溶液的制備 取適量無水葡萄糖對(duì)照品，精密稱定，以蒸餾水為溶劑制成每1毫升含葡萄糖0.1 mg的溶液[25]，即對(duì)照品溶液。

2.6.2 供試品溶液的制備 取魔芋粉末約0.2 g，精密稱定，置干燥的圓底燒瓶中，按文獻(xiàn)[26]進(jìn)行操作，即為供試品溶液。

2.6.3 測(cè)定波長的選擇 精密量取“2.6.1”、“2.6.2”溶液各2.0 mL，置于具塞10 mL刻度試管中。采用硫酸-苯酚法顯色后[26]，以相應(yīng)試劑為空白，按紫外-可見分光光度法(通則0401)[22]，在300～600 nm波長掃描。結(jié)果如圖4所示。

1：對(duì)照品溶液；2：供試品溶液圖4 葡萄糖對(duì)照品與供試品溶液顯色曲線圖

2.6.4 線性關(guān)系考察 以0.2 mL為增加量，分別精密量取“2.6.1”項(xiàng)下溶液0.2～1.4mL，7個(gè)不同體積溶液，至具塞10 mL刻度試管中，各加水定容至2 mL。照“2.6.3”方法在490 nm的波長處測(cè)定吸光度值，分別以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。結(jié)果如圖5所示，其標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=48.014x+0.0096，在0.0025～0.0175 mg/mL范圍內(nèi)(R2=0.9997)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.6.1”溶液1.0 mL，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，照“2.6.3”的方法，測(cè)定吸光度。同法測(cè)定6次，結(jié)果見表4；RSD為0.17%，表明該臺(tái)儀器的精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn) (n=6)

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批魔芋粉末約0.2 g，共6份，精密稱定，按“2.6.2”、“2.6.3”方法制備樣品測(cè)定吸光度，計(jì)算魔芋總多糖的重量 (mg)，計(jì)算，即得。結(jié)果見表5。RSD<3%，該提取方法重復(fù)性符合要求。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.6.7”項(xiàng)下方法提取供試品1份，同時(shí)制備空白試劑，于490 nm測(cè)其吸光度，每0.5小時(shí)測(cè)1次，共測(cè)6次。結(jié)果見表6。RSD為1.7%，表明此供試品溶液在考察的2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn) (n=6)

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn) (n=6)

2.6.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定出含量的魔芋粉末約0.1 g，按文獻(xiàn)[26]操作，計(jì)算魔芋總多糖的重量 (mg)，即得。結(jié)果見表7。平均回收率為100.5%，RSD為2.5%，表明該方法準(zhǔn)確度符合分析要求。

表7 加樣回收率 (n=6)

2.6.9 樣品測(cè)定 10批魔芋樣品，按“2.6.2”、“2.6.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定吸光度值，結(jié)果：10批魔芋總多糖的含量13.10%～18.30%，平均值14.82%，暫定總多糖含量不低于11.7%。結(jié)果見表8。

3 討論

實(shí)驗(yàn)考察了酸不溶性灰分的含量，所得結(jié)果均小于1%，由于含量較低，3個(gè)平行樣之間離散程度較大；查閱中國藥典(2020版)，同屬天南星科植物，半夏、天南星均為塊莖類藥用，千年健、石菖蒲為根莖類，酸不溶性灰分均不在考察項(xiàng)內(nèi)，魔芋的藥用部位同為塊莖，市售藥材有去皮和不去皮，且均需經(jīng)過清洗，表面泥沙大部分已經(jīng)被洗去，結(jié)合實(shí)驗(yàn)前期研究，可能該屬植物藥用部位氧化硅及泥沙含量均較少。故本次研究不納入酸灰項(xiàng)。

以乙酸乙酯-冰醋酸-水(2∶1∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(5∶1∶1) 、正丁醇-乙酸乙酯-吡啶-水(6∶1∶5∶4)[27]，正丁醇-冰醋酸-水(2∶1∶1)[20]、正丁醇-乙酸乙酯-水(7∶2∶1)、分別進(jìn)行點(diǎn)樣展開。結(jié)果以正文中展開劑比例最宜，熒光斑點(diǎn)清晰，不拖尾，重現(xiàn)性好，故實(shí)驗(yàn)最后選用正丁醇-冰醋酸-水(2∶1∶1)的比例展開。

浸出物實(shí)驗(yàn)過程中，可能因?yàn)槟в笾卸嗵呛枯^高，且藥材性質(zhì)特殊，以水作為溶劑測(cè)定時(shí)，藥材溶脹、體積膨大，形成膠凝的塊狀，以此溶劑熱浸法、冷浸法均無法過濾。故本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定魔芋醇溶性浸出物。經(jīng)過對(duì)冷浸法、熱浸法以及不同乙醇濃度的考察，結(jié)果可能魔芋30%醇浸出物中多糖含量較多，過濾困難；而采用熱浸法，50%乙醇為溶劑，其浸出物較容易過濾，與考察的其他醇濃度試驗(yàn)相比浸出物含量相比而言為最高，因此，采用 50%乙醇為溶劑測(cè)定魔芋醇溶性浸出物較合理。

魔芋藥材中的主要成分為葡甘聚糖。據(jù)報(bào)道[26,28-30]，魔芋的葡甘聚糖類成分具有降低血脂、預(yù)防及輔助治療糖尿病，清理腸道、改善肥胖，此外還有抗癌、降低膽固醇等功能，其含量相對(duì)較高，經(jīng)查閱文獻(xiàn)其他成分無論是含量還是藥理研究都不如多糖深入，因此建立以魔芋總多糖為指標(biāo)的含量測(cè)定方法較為合適，研究中對(duì)料液比，提取時(shí)間，提取的溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見文獻(xiàn)[26]，結(jié)果文中方法提取率高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，建議可以作為參考。

魔芋為貴州少數(shù)民族習(xí)用藥材，也是貴州部分地區(qū)特色食材，無論從食用還是藥用層次都是極具開發(fā)利用價(jià)值，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)在質(zhì)量控制方面的參考較少。文獻(xiàn)報(bào)道的魔芋藥材質(zhì)量研究有的藥用部位并不相同，有的完整性、規(guī)范性欠缺。目前魔芋種植量大，市場(chǎng)卻比較混亂，沒有科學(xué)合理的規(guī)范約束行業(yè)生產(chǎn)。本研究探討了有關(guān)魔芋藥材定性、定量方面的研究，定性研究中顯微特征明顯，薄層色譜斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性佳，水分、灰分、浸出物測(cè)定方法可行；定量研究建立了以多糖為指標(biāo)的含量測(cè)定。為魔芋的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的參考，對(duì)民族藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究及開發(fā)利用等都具有重要意義。