◎ 楊 軍，熊 銳，黃 晶，陳 幟，梅 霞

(常德市食品檢驗(yàn)所，湖南 常德 415000)

硼砂和硼酸具有增加食物韌性、脆度及改善食物保水性及保存度等功能[1]。硼砂經(jīng)由食品攝取后，可與胃酸作用產(chǎn)生硼酸，硼酸不易被排出具有積存性，連續(xù)攝取后，會(huì)在體內(nèi)蓄積，阻礙消化酵素作用，引起食欲減退、消化不良，抑制營養(yǎng)素的吸收，并產(chǎn)生嘔吐、腹瀉、紅斑、循環(huán)系統(tǒng)障礙、休克及昏迷等癥狀[2]。雖然世界各國都早已禁止使用硼酸和硼砂用于食品添加，但是仍有非法添加現(xiàn)象存在，在面制品中使用尤為頻繁。目前食品中硼砂或硼酸檢測方法為分光光度法[3]，相關(guān)研究中還有甲亞胺分光光度法[4]、原子吸收分光光度法[5]、電感耦合等離子體光譜法[6]和液相色譜法等檢測方法[7]。

姜黃素分光光度法是利用硫酸與姜黃混合生成的質(zhì)子化姜黃與硼酸反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，溶液顏色的深淺與樣品中硼酸含量成正比，通過比色可測定硼酸的含量；甲亞胺分光光度法主要利用甲亞胺的衍生物3-甲氧基-甲亞胺H作為硼顯色劑。兩種方法存在的主要問題有以下2點(diǎn)。①前處理費(fèi)時(shí)且操作時(shí)間長，姜黃素法樣品前處理涉及沉淀蛋白質(zhì)、使用有機(jī)萃取等費(fèi)時(shí)費(fèi)力操作[3]；甲亞胺分光光度法樣品前處理需要進(jìn)行樣品消解或者高溫灰化[4]。②兩種分光光度法會(huì)使用到三氯甲烷、濃硫酸等毒性較大試劑或較危險(xiǎn)試劑，檢測安全性上有隱患。此外，在環(huán)境檢測領(lǐng)域常用有熒光光度法和原子吸收分光光度法測定硼元素，但是在食品中檢測研究較少，且前處理涉及樣品消解或高溫灰化，也比較費(fèi)時(shí)；原子吸收需要到特殊涂層的原子石墨爐，電感耦合等離子體光譜法和液相色譜法儀器成本高、檢測成本高、不易于大規(guī)模推廣?，F(xiàn)有檢測硼酸的熒光光度法使用水反應(yīng)體系，食品類樣品成分復(fù)雜，水提取溶液中會(huì)帶來大量熒光干擾物質(zhì)，產(chǎn)生無法消除影響，限制了食品類樣品檢測應(yīng)用。因此開發(fā)出一種準(zhǔn)確率高、樣品前處理簡單、檢測時(shí)間短和檢測成本低的硼酸檢測方法對于食品安全監(jiān)管具重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆干、掛面、面包、臘牛肉、醬板鴨和醬板魚。

硼砂，分析純，麥克林；硼酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（200 μg·mL-1），壇墨之間科技股份有限公司；正己烷，分析純，國藥集團(tuán)；鹽酸，GR，國藥集團(tuán)；氫氧化鈉（9.6 g·L-1）。

茜素紅溶液：分別用水、50%（V/V）甲醇水、50%（V/V）乙醇水將茜素紅配制成1.0×10-3mol·L-1，作為各反應(yīng)體系顯色劑；pH緩沖溶液：分別用水、50%（V/V）甲醇水、50%（V/V）乙醇水將磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別溶解為6.0×10-2mol·L-1，臨用前按體積比1∶1，作為各反應(yīng)體系的pH緩沖溶液；硼酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別用水、50%（V/V）甲醇水，50%（V/V）乙醇水將硼酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成 0 mg·L-1、0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-18個(gè)梯度，作為各反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 儀器與設(shè)備

F97PRO熒光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；ML204T/02萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9246D電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乙醇做提取劑的樣品前處理

稱取粉碎烘干后的食品10 g于50 mL塑料離心管中，加入25 mL無水乙醇、500 μL濃鹽酸，渦旋振蕩5 min后，于5 000 r·min-1離心機(jī)中離心3 min，取上清液5.0 mL于15 mL塑料離心管中，加入9.6 g·L-1的氫氧化鈉水溶液5 mL后搖勻，再加入2 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，于5 000 r·min-1離心機(jī)中離心3 min，去除上層正己烷層，下層清液為樣品待測溶液。

1.3.2 甲醇做提取劑的樣品前處理

稱取粉碎烘干后的食品樣品10 g于50 mL塑料離心管中，加入2.5 g氯化鈉、40 mL甲醇，渦旋振蕩5 min后，于5 000 r·min-1離心機(jī)中離心3 min，取上清液5.0 mL于15 mL塑料離心管中，加入5 mL純水后搖勻，再加入4 mL正己烷，渦旋振蕩30 s,于5 000 r·min-1離心機(jī)中離心3 min，去除上層正己烷層，下層清液為樣品待測溶液。

1.3.3 顯色及檢測

分別移取2 mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和樣品待測溶液于10 mL塑料比色管中，依次加入pH緩沖溶液7 mL和茜素紅溶液1 mL，搖勻后置于溫度恒定處待溶液溫度穩(wěn)定后用1 cm石英比色皿在激發(fā)波長460 nm，發(fā)射波長598 nm處用顯色后的0標(biāo)校零，分別測量顯色后的標(biāo)品和樣品溶液，用儀器自帶工具擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品溶液熒光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)硼酸濃度，結(jié)合樣品前處理的稀釋倍數(shù)，可以計(jì)算出樣品中硼酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的選定

根據(jù)已有研究的反應(yīng)條件，硼酸、茜素紅與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖水溶液混合后，使用儀器自帶三維波長掃描[8]。如圖1和圖2所示確實(shí)有比較明顯的特征峰，且茜素紅以及與硼酸和硼砂形成的形的絡(luò)合物形成的特征峰重和，最大激發(fā)波長都在460 nm左右，發(fā)射波長都在598 nm左右。

圖1 茜素紅熒光三維掃描等高圖

圖2 硼酸茜素紅熒光三維掃描等高圖

2.2 茜素紅濃度的確定

茜素紅自帶熒光特性且與形成的目標(biāo)絡(luò)合物特征峰重疊，因此盡量降低茜素紅用量可以降低茜素紅本底值的影響，在10 mL的顯色反應(yīng)中使用1.0×10-3mol·L-1茜素紅溶液1 mL即可保證硼酸濃度在0.1～100.0 mg·L-1范圍熒光值與濃度成正比，滿足大多數(shù)情況下的檢測需求。

2.3 緩沖溶液的選定

加入硼酸后，茜素紅溶液在pH值為6.0～9.0的各緩沖溶液中，均能檢測到比較明顯的熒光增強(qiáng)，但是隨緩沖溶液濃度增大，茜素紅本底熒光值升高明顯，也會(huì)導(dǎo)致在有機(jī)反應(yīng)體系中導(dǎo)致鹽溶液析出，經(jīng)過擇優(yōu)選擇6.0×10-2mol·L-1磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，臨用前按體積比1∶1混勻后使用顯色較為穩(wěn)定。

2.4 不同反應(yīng)體系對檢測的影響

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在顯色反應(yīng)中加入有機(jī)溶劑后，能夠提高硼酸或硼砂和茜素紅形成的絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度，且體積比在50%左右時(shí)能達(dá)到最大增強(qiáng)效果，其中甲醇和乙醇都能形成較強(qiáng)增強(qiáng)作用，乙腈帶來提升很少。根據(jù)圖3不同反應(yīng)體系三維波長掃描圖所示，將所有溶液的溶劑換為體積比為50%有機(jī)水溶液形成的不同反應(yīng)體系，可以顯著提升絡(luò)合物的熒光值，提高檢測靈敏度。目前嘗試的有機(jī)溶劑中，甲醇對熒光顯色提升作用最大，比純水反應(yīng)體系提高約3.7倍，擇優(yōu)選擇50%甲醇水作為該實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溶劑。3種反應(yīng)體系中，硼酸在0.1～100.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)均能保證熒光強(qiáng)度與硼濃度成正比，如圖4所示擬合直線線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。

圖3 硼酸茜素紅顯色反應(yīng)中加入不同溶劑后的熒光三維掃描圖

圖4 硼酸在不同反應(yīng)體系中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 溫度和時(shí)間對檢測的影響

樣品提取溫度和顯色反應(yīng)溫度對最終檢測結(jié)果影響并不大，硼酸或硼砂與茜素紅能夠快速的形成的穩(wěn)定的絡(luò)合物，但是檢測溫度對熒光檢測影響比較大。圖5為10.0 mg·L-1硼酸顯色后在不同溫度下熒光強(qiáng)度，圖6為10.0 mg·L-1硼酸顯色后在不同時(shí)間段檢測的熒光值，考慮到檢測樣品過程中可能會(huì)帶來溶液溫度的變化，在恒溫條件將在顯色后溶液置于恒溫環(huán)境中反應(yīng)10 min再檢測，同時(shí)熒光光度計(jì)也置于相同恒溫環(huán)境且提前預(yù)熱恒溫，如圖6所示在90 min內(nèi)可以保證檢測熒光值穩(wěn)定。

圖5 溫度對熒光檢測強(qiáng)度影響圖

圖6 顯色時(shí)間對熒光強(qiáng)度影響圖

2.6 不同提取劑加標(biāo)回收率檢測

根據(jù)硼酸和硼砂的物理性質(zhì)以及純標(biāo)品提取驗(yàn)證，水、甲醇、純乙醇均可作為硼酸的提取劑；水和甲醇可以作為硼砂提取劑，而硼砂通過在乙醇中加入濃鹽酸酸化后也可使用乙醇作為提取劑，但是使用含水溶劑進(jìn)行樣品提取，會(huì)出現(xiàn)無法消除的熒光本底，無法實(shí)現(xiàn)檢測，因此樣品在提取前都需要烘干水分以降低雜質(zhì)本底。如果使用純甲醇或純乙醇提取，則能避免水溶性熒光雜質(zhì)干擾，大大降低了本底值，甲醇提取過程中通過加入氯化鈉可進(jìn)一步降低雜質(zhì)帶來的本底。提取后的純有機(jī)樣品提取液，會(huì)帶來脂溶性雜質(zhì)，在50%甲醇水反應(yīng)體系中會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，需要在顯色前通過加入等體積水析出脂溶性雜質(zhì)再通過正己烷去脂解決。

根據(jù)表1驗(yàn)證數(shù)據(jù)，通過對常用食品樣品的進(jìn)行低濃度液標(biāo)及高濃度固標(biāo)加標(biāo)驗(yàn)證，使用甲醇或酸化后乙醇作為提取劑，樣品加標(biāo)濃度在20.0～800.0 mg·kg-1內(nèi)都能保證比較好的添加回收率，因此該方法適合大部分種類樣品的檢測。

表1 不同提取劑的樣品加標(biāo)回收率表

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)探究，發(fā)現(xiàn)硼酸與茜素紅的熒光顯色特性由于其高靈敏性及穩(wěn)定性，可以用于食品中硼酸的檢測。根據(jù)已有驗(yàn)證數(shù)據(jù)，將樣品粉碎烘干后，通過甲醇+氯化鈉或者這乙醇+鹽酸的方式提取，再結(jié)合正己烷除脂得到的樣品待測液，在50%甲醇-水反應(yīng)體系中，可以快速準(zhǔn)確的完成食品中硼酸后硼砂，樣品前處理簡單易行，所用試劑易得且相對安全，檢測所需的熒光檢測儀成本遠(yuǎn)低于液相色譜、原子吸收等大型儀器，適合大部分固體食品類樣品的快速檢測，利于推廣運(yùn)用。但是該方法暫時(shí)無法檢測基質(zhì)復(fù)雜的液體類食品，針對液體樣品的前處理方法還需要進(jìn)一步研究。