◎ 孫 彪

（甘肅省武威市政府網(wǎng)站，甘肅 武威 733000）

現(xiàn)階段，較多學(xué)者正在研究應(yīng)用丙酸桿菌完成丙酸的制備。但不同培養(yǎng)基的菌群分離效果不一致，在篩選和鑒定菌株的方式上存在差異性?；诖?，本文研究牛奶中丙酸桿菌的篩選和鑒定方法，并探討從牛奶中分離出來的菌種類型，為其早日投入工業(yè)化生產(chǎn)提出理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

新鮮生牛乳，甘肅省武威市涼州區(qū)興旺奶肉牛廠；ATCC25923金黃色葡萄球菌，美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；DNS試劑，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；高錳酸鈉，廣東航鑫科技股份公司；硫氫化鈉試劑，菏澤宏昌生物科技有限責(zé)任公司。

光學(xué)顯微鏡，型號為Axio Vert.A1，北京普瑞賽司儀器有限公司；色譜儀，型號為GC7890，山東神礦重工有限公司；生化培養(yǎng)箱，型號為SRT-1270，上海程斯智能科技有限公司；冷凍離心機(jī)，型號為DL6M，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；分光計(jì)，型號為UV-9100，北京瑞利分析儀器公司；西亞試劑盒，成都西亞化工股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備菌種培養(yǎng)基

以新鮮牛奶為樣品梯度稀釋原材料，將牛奶均勻涂在實(shí)驗(yàn)試劑存放平板上，按照丙酸桿菌的分離培養(yǎng)基形式進(jìn)行培養(yǎng)[1]。此次實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基類型分為篩選培養(yǎng)基與分離培養(yǎng)基2種，在3種培養(yǎng)基制備過程中選擇其中一組進(jìn)行對比，以分離培養(yǎng)基作為丙酸桿菌的對照組，按照同等形式進(jìn)行各類型菌種制備。

在篩選培養(yǎng)基中加入2%的葡萄糖和0.000 2%的粘菌素。分離培養(yǎng)基中加入2%的甘油成分，加入10%葡萄糖，2種培養(yǎng)的pH值均控制在6.7～7.2。

通過對菌種培養(yǎng)基的進(jìn)行分類制備，在菌種發(fā)酵后進(jìn)行離心處理，整個離心過程控制在4 000 r·min-1，即可獲取觀察清液。在38 ℃的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，24 h內(nèi)通過儀器觀察到的菌種變化情況，選擇肉眼可見且成長速度較快的單個菌落進(jìn)行分離純化，并根據(jù)菌落的分布特點(diǎn)進(jìn)行初步歸檔分類，完成丙酸桿菌的待選菌株篩選。

1.2.2 分離純化培養(yǎng)丙酸桿菌

在每個需要分離的菌體溶液中，按照1～10 mL的大小進(jìn)行試管準(zhǔn)備。分離全過程包括樣本的初選和復(fù)選，多次篩選能分離出較為純化的丙酸桿菌[2]。初選時將鮮牛奶分成若干等分，通過上述3種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)制備，在恒定的35 ℃保養(yǎng)箱中靜置4 d。

初次先在篩選培養(yǎng)基中吸取2 mL溶液，同時與2 mol·L-1硫酸進(jìn)行混合，在試管中進(jìn)行煮沸判斷氣體中是否有酸性物質(zhì)產(chǎn)出。若沒有，則將等量分配的鮮牛奶重復(fù)上述步驟，直到存在酸性物質(zhì)產(chǎn)生。若產(chǎn)生了揮發(fā)酸物質(zhì)，可將篩選培養(yǎng)基中的物質(zhì)分出15%，嫁接到富集培養(yǎng)基中進(jìn)行為期3 d的培養(yǎng)。通過反復(fù)嫁接接種，在進(jìn)行4輪后可完成生理純化增殖，使得丙酸桿菌具有優(yōu)勢菌的特點(diǎn)。

在完成反復(fù)培養(yǎng)后對分離培養(yǎng)基進(jìn)行平均分離，將其置于在35 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，維持在7 d以上，直接進(jìn)行單個菌落的挑取即可。將通過分離得到的丙酸桿菌接種在帶有篩選培養(yǎng)基的容器內(nèi)，在溫度在30～35 ℃進(jìn)行為期5 d的培養(yǎng)，直至篩選出具有較大程度的乳白色發(fā)酵液體，再利用高效液相色譜進(jìn)行丙酸桿菌的定量轉(zhuǎn)化。

1.2.3 高效液相色譜分析

將菌種按照體積分類，以3%的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行接種量配比定量轉(zhuǎn)化，對每個染色后的菌株編號，進(jìn)行培養(yǎng)物的提取和菌體收集。被打濕的菌體需要和谷氨酸鈉溶液進(jìn)行充分混合，分別在35 ℃、65 ℃及85 ℃下進(jìn)行振蕩，每次融合的溶液按照1∶40（m/v）進(jìn)行，在細(xì)胞液完成洗脫制備后，進(jìn)行高效液相色譜的定量轉(zhuǎn)化定性分析[3]。

對篩選分離的丙酸桿菌進(jìn)行定量分析，按照高效液相色譜法進(jìn)行洗脫程序設(shè)定。按照AGILENT的色譜柱采集標(biāo)準(zhǔn)，在紫外線監(jiān)測儀器測試波長為355 nm的長度下，進(jìn)行25 mm×5.2 mm，10 μm的色譜柱洗脫。其流動相選用5 mmol·L-1的稀硫酸溶液，其流動相流速設(shè)定為0.5 mL·min-1，柱溫設(shè)定為30 ℃，進(jìn)樣間隔設(shè)定為20.5 min，質(zhì)量濃度與峰面積的回歸方程為y=559 847x+29 157，式中x代表質(zhì)量濃度，單位為g·L-1；y代表峰面積，其決定系數(shù)r2=0.999 8。將3組定量轉(zhuǎn)化完成的培養(yǎng)基進(jìn)行丙酸桿菌的形態(tài)鑒定及生化鑒定。

1.2.4 丙酸桿菌形態(tài)、生化鑒定

（1）丙酸桿菌形態(tài)鑒定。定量轉(zhuǎn)換完成后，將兩個培養(yǎng)基中培養(yǎng)的丙酸桿菌菌株放置于超凈工作臺中，分別挑選單獨(dú)菌落進(jìn)行革蘭氏染色至G+，放置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)鑒定。丙酸桿菌外觀為桿狀，大小為0.4～0.7 μm，菌落呈白色、無芽孢、不運(yùn)動，依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)完成丙酸桿菌形態(tài)鑒定。

（2）丙酸桿菌生化鑒定。在丙酸桿菌生成量的對比中，40 min獲取一次生成量數(shù)據(jù)，并進(jìn)行生化鑒定。

采用DNS法測定葡萄糖的殘留量。取不同濃度的葡萄糖溶液各1 mL，分別加入DNS試劑，水浴加熱5 min，取出冷卻后，用水定容至10 mL，顯色后測試其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后再選取葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的丙酸桿菌在蒸餾水中定容，進(jìn)行葡萄糖殘留量的測定[4]。

每40 min利用比色法測定甘油的殘留量。取不同濃度的甘油溶液各1 mL，利用高錳酸鈉溶液和硫氫化鈉試劑測定其吸收波長，顯色后在412 nm下利用分光計(jì)測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后再選取甘油培養(yǎng)基培養(yǎng)的丙酸桿菌在蒸餾水中定容，進(jìn)行甘油殘留量的測定[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)鑒定

通過實(shí)驗(yàn)制備丙酸桿菌菌株，對其進(jìn)行形態(tài)鑒定。不同培養(yǎng)基指標(biāo)下菌群樣本形態(tài)特征如圖1所示。由圖1（a）和圖1（b）可知，不同變化指標(biāo)下生成的丙酸桿菌形態(tài)不一致，呈現(xiàn)出來的分布效果也不同。

圖1 不同培養(yǎng)基指標(biāo)下菌群樣本形態(tài)特征圖

2.2 不同培養(yǎng)基的丙酸桿菌生成量對比

為驗(yàn)證兩個變量對丙酸桿菌的影響，以同等制備丙酸桿菌的時間內(nèi)，進(jìn)行兩個指標(biāo)下丙酸的生成量對比測試，具體測試結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)圖2內(nèi)容所示，在葡萄糖培養(yǎng)基中丙酸的生成量變化較大，甘油培養(yǎng)基中丙酸的生成量較為穩(wěn)定。對比兩個指標(biāo)下的丙酸生產(chǎn)高值來看，葡萄糖培養(yǎng)基中的生成量最大值能達(dá)到7.0 g·L-1，甘油中的丙酸生成量最高為 6.2 g·L-1。

2.3 丙酸桿菌生化鑒定對比

在完成丙酸的生成含量測試后，對其桿菌內(nèi)部的殘留量加以測試，驗(yàn)證不同變化指標(biāo)的發(fā)酵能力。以同等時間變化下兩者殘留量為對比條件，在3個樣本中對照培養(yǎng)時間點(diǎn)，進(jìn)行多輪殘留量的結(jié)果對比，具體結(jié)果如表1所示。

根據(jù)表1中內(nèi)容所示，在3組樣本中葡萄糖和甘油2種指標(biāo)均能被消耗，但不同培養(yǎng)基含量中的消耗速度不同。葡萄糖的消耗量較快，在第160 h之前消耗完成；而甘油的消耗量較慢，只有在初期才會發(fā)生較大數(shù)值變化，后期消耗速度比較平穩(wěn)。由此能夠得出結(jié)論：葡萄糖和甘油的殘留量主要與丙酸的生成量相關(guān)，生成的速度越快，其殘余量越少。

表1 丙酸桿菌中葡萄糖及甘油指標(biāo)殘留量對比結(jié)果表（單位：g·L-1）

3 結(jié)論

本文在制備不同類型的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，以葡萄糖和甘油作為丙酸桿菌的變化量，設(shè)計(jì)牛奶中丙酸的篩選和鑒定方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，分別將葡萄糖和甘油放入培養(yǎng)基內(nèi)，在不同培養(yǎng)時間內(nèi)測試丙酸的生成量，選用葡萄糖培養(yǎng)基，在180 h內(nèi)能夠生成7 g·L-1的丙酸含量，具有實(shí)際應(yīng)用效果。但由于在測試過程中只針對制備的篩選項(xiàng)培養(yǎng)基進(jìn)行測試，所得結(jié)果具有一定偏差性，后續(xù)研究中會進(jìn)行更多側(cè)重點(diǎn)分析，為丙酸桿菌的篩選和鑒定提供科學(xué)方法。