◎ 王 瑜，郭愛娟

（1.青島市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266000；2.歐陸分析檢測技術(shù)服務(wù)（青島）有限公司,山東 青島 266000）

谷物在生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)藏及運(yùn)輸過程中，可能因處理不當(dāng)而出現(xiàn)霉變，導(dǎo)致感染真菌毒素。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又稱嘔吐毒素，廣泛存在與霉變糧食中，DON及其衍生物能夠引發(fā)發(fā)燒、嘔吐、腹瀉的癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)θ藗兊纳踩斐赏{[1-2]。本文通過HLB固相萃取柱來凈化樣品，建立谷物以及制品中DON及其衍生物的高效液相測定法，以提高我國的食品安全水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷物樣品（大米26份、玉米糝20份、掛面24份和小麥粉26份），市售。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（D3G），50 μg·mL-1；15- 乙 酰 基 脫 氧 雪 腐 鐮 刀 菌 烯 醇（15ADON）、3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?ADON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標(biāo)準(zhǔn)溶液，100 μg·mL-1；實(shí)驗(yàn)室自制超純水，正己烷、乙酸銨、甲醇和乙腈為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

流速為0.3 mL·min-1，流動(dòng)相A為乙腈，B為2 mmol·L-1乙酸銨溶液，流動(dòng)相體積比為A∶B=35∶65；Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫為 35 ℃，進(jìn)樣量為 5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正負(fù)離子同時(shí)進(jìn)行掃描，多反應(yīng)監(jiān)測。離子源溫度為600 ℃，電噴霧電壓為4 500～5 500 V，碰撞室出入口的電壓均為10 V，輔助氣、霧化氣及氣簾氣的壓力分別為344.75 kPa、379.23 kPa和310.28 kPa，碰撞氣壓力中等，掃描時(shí)間為3.5～8.5 min。

1.2.3 樣品處理

（1）處理1。取樣2.5 g，加10.0 mL水，超聲提取 20 min，5 000 r·min-1離心 10 min， 過 0.22 μm 膜待測。

（2）處理2。取樣2.0 g，加20.0 mL的75%乙腈水溶液，超聲提取20 min，5 000 r·min-1離心10 min，取5.0 mL上清液過HLB柱，取過柱液5.0 mL氮?dú)獯蹈?，定容?.0 mL，過0.22 μm膜后待測。

（3）處理3。在50 mL離心管中放置2 g的試樣，加入20 mL的75%乙腈水溶液，5 000 r·min-1離心10 min，超聲20 min，收集上清液。在50 mL離心管中加入5 mL的上清液，并加入乙腈飽和的正己烷溶液 10 mL，混合 2 min，5 000 r·min-1離心 5 min；去除正己烷層，50 ℃氮?dú)獯蹈?，使? mL水溶解殘?jiān)⒌却齼艋Ｊ褂肏LB固相萃取柱，甲醇和水各3 mL活化平衡。（2）中制備的溶液上柱，流速為每秒1～2滴。分別采用5%甲醇水溶液1 mL與水3 mL對柱子進(jìn)行淋洗，抽干后用5 mL甲醇洗脫，50 ℃氮?dú)獯蹈?。加? mL流動(dòng)相溶液，混勻，過0.22 μm濾膜后等待進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件

對4種真菌毒素在不同的電離模式下的響應(yīng)情況進(jìn)行研究，3ADON與15ADON是同分異構(gòu)體，其在[M-H]-與[M+H]+模式下響應(yīng)都比較高，但[M+H]+模式有著比較大的離子對干擾，因此使用[M-H]-模式進(jìn)行監(jiān)測。D3G在[M-H]-與[M+H]+模式下響應(yīng)都比較低，在[M+NH4]+模式有著比較高的響應(yīng)，所以采用[M+NH4]+模式檢測。DON采用[M-H]-監(jiān)測，其基線干擾會(huì)比較少，有較高的響應(yīng)。在這4種真菌中，D3G脫去葡萄糖苷基團(tuán)后會(huì)變?yōu)镈ON，優(yōu)化洗脫梯度與色譜柱，能夠得到較好的分離度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采取T3色譜柱按照本實(shí)驗(yàn)方法洗脫時(shí)，能夠有效分離這4種化合物，如圖1所示。

圖1 4種毒素的總離子流圖

2.2 優(yōu)化樣品前處理方法

由表1可知，前處理方式3的上機(jī)液比較干凈，并且4種毒素的回收率和重復(fù)性較好，本文采取前處理3的方式進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同前處理方式的回收率表

2.3 4種毒素的回收率和線性關(guān)系

如表2所示，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)上述的方法和儀器條件測定，最終得出4種毒素在5.0～250.0 μg·kg-1范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，檢出限均為 10 μg·kg-1，定量限為 20 μg·kg-1。

表2 4種毒素的線性方程與相關(guān)系數(shù)表

如表3所示，4種毒素在不同樣品中的加標(biāo)回收率結(jié)果表明：方法的平均回收率為89.6%～118.1%，RSD為1.6%～8.7%。

表3 4種毒素在不同樣品中的加標(biāo)回收率表

2.4 樣品污染情況

對4種毒素在不同樣品中的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，只有小麥粉檢出3ADON，所有樣品均未檢出15ADON；DON的含量和檢出率比D3G高，含量最高的是掛面。樣品檢出DON時(shí)其他3種毒素不一定檢出，而檢出其他3種毒素時(shí)一定會(huì)檢出DON，即DON的檢出率能夠代表樣品中毒素的檢出率。在所有樣品中，毒素檢出率依次為DON＞D3G＞3ADON＞15ADON。由表4可知，4類谷物中，DON毒素檢出率最高的是掛面，達(dá)到了84.4%，其次是小麥粉，因此可以看出，掛面的污染最為嚴(yán)重。

表4 谷物制品中DON和D3G的含量表

3 結(jié)論

當(dāng)前，雖然沒有直接證據(jù)證明隱蔽型真菌毒素的毒性強(qiáng)于原型的真菌毒性，但有研究數(shù)據(jù)表明，一些隱蔽型真菌毒素在代謝過程中可能會(huì)被水解，并釋放出毒素原型[3-4]。因此，隱蔽型真菌毒素是危害消費(fèi)者健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)之一[5]。

本研究的數(shù)據(jù)印證了這種風(fēng)險(xiǎn)的存在，DON與其隱蔽型D3G在谷物中的污染不容忽視。本文建立的檢測方法，可以滿足谷物及谷物制品中DON及其衍生物的檢測要求，對保證我國食品安全具有重要意義。