李曉紅，詹 毅，虞 立，金偉鋒

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053；2.安徽省新貝生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江諸暨 311800)

三角帆蚌()是我國主要的淡水育珠蚌，廣泛地分布于安徽、浙江、江蘇和湖北等地。育珠蚌在進(jìn)行插核手術(shù)后，傷口極易感染病菌，致使育珠蚌吐核甚至死亡，讓珍珠養(yǎng)殖戶遭受經(jīng)濟(jì)損失。為了提高珍珠的產(chǎn)量和品質(zhì)，很多研究者從育珠環(huán)境、外套膜細(xì)胞的培育、術(shù)前術(shù)后處理以及細(xì)胞小片的處理等方面對(duì)有核珍珠培育技術(shù)做了大量的研究和實(shí)踐工作。也有研究者對(duì)珠核的材質(zhì)和固核技術(shù)進(jìn)行探索和研究，李詠梅等將珠核用處理液浸泡后再植入育珠蚌體內(nèi)，取得了很好的育珠效果。從現(xiàn)有的研究來看，尚未有研究者使用珠核表面包裹藥物，制成包藥珠核，將具有消炎抗菌、滋養(yǎng)育珠蚌的作用。

為了降低育珠蚌死亡率，很多養(yǎng)殖戶向水面潑灑抗生素或者投喂含有抗生素的餌料，以達(dá)到消炎抗菌的目的。長此以往，不僅污染了水體環(huán)境，也危害到人類的健康。因此，藥物配方和用藥方式對(duì)于提高珍珠的品質(zhì)和保持生態(tài)環(huán)境尤為重要。由于中藥含有的多種有效成分具有抗菌消炎，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力的功能，可以有效解決耐藥性和藥物殘留的問題，目前已廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。多項(xiàng)研究表明，中藥黃芪所含有的黃芪多糖能有效增強(qiáng)動(dòng)物的非特異免疫活性，促進(jìn)動(dòng)物生長。黃霉素具有毒性低，不易與其他抗生素產(chǎn)生拮抗作用，安全性高等特點(diǎn)，是國家認(rèn)定的動(dòng)物“綠色”飼料添加劑。

近年來，很多學(xué)者將向后反饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(back propagation neural network,BPNN)模型與遺傳算法(genetic algorithm,GA)的尋優(yōu)功能相結(jié)合來研究中藥有效成分提取工藝條件優(yōu)選的問題。由于在訓(xùn)練模型的過程中追求擬合誤差的最小化，導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)中隱層神經(jīng)元數(shù)目增多，使網(wǎng)絡(luò)模型出現(xiàn)過度擬合。同時(shí)，傳統(tǒng)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值往往會(huì)使算法陷入局部極值，導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練失敗。而利用遺傳算法的全局尋優(yōu)功能，優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，并利用全局尋優(yōu)功能，找到全局最優(yōu)解，更加符合包藥珠核各藥物濃度之間非線性的特征。本實(shí)驗(yàn)對(duì)珠核包衣中黃芪藥液的適宜濃度、黃霉素和土霉素的藥液的適宜濃度進(jìn)行測(cè)試，以育珠蚌死亡率、成珠率、優(yōu)質(zhì)珠率為指標(biāo)，采用遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，以期探索一種新型包藥珠核的生產(chǎn)工藝方法，優(yōu)化包衣中各種藥物成分的配比提高淡水珍珠的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取體質(zhì)健康、體長100～130 mm的2齡三角帆蚌為育珠蚌，體長50～80 mm的1齡蚌制做細(xì)胞小片，均由浙江省諸暨山下湖珍珠養(yǎng)殖基地培育。

珠核由淡水麗蚌殼研磨而成，正球形，直徑2.5 mm，表面光滑，符合質(zhì)量要求。制作包藥珠核的藥物[黃霉素(批號(hào)：11015-37-5)、土霉素(批號(hào)：031161018)和中藥材黃芪(批號(hào)：1731213)]均購自江山市萬里中藥材有限公司。

1.2 包藥珠核的制做

稱取3 600 g干燥的黃芪，切片后放入過濾袋，扎緊袋口并留有一定空余，放入裝中藥煎藥機(jī)玻璃桶，加入6 000 mL清水浸泡30 min。設(shè)置高火煎煮20 min，轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，過濾，收集濾液，查看藥液體積，如不足1 800 mL，則在藥液中加入清水至1 800 mL，冷卻至常溫備用。取黃霉素18 g溶于180 mL清水，土霉素18 g溶于20 mL濃度95%的乙醇溶液。將配置好的三種藥液混合，則混合藥液中黃芪生藥濃度為1.8 g/mL，黃霉素的濃度為9 mg/mL，土霉素的濃度為9 mg/mL。類似的，可以配制正交實(shí)驗(yàn)組其他方案所需的混合藥物。

將珠核放入注有清水的滾筒中滾動(dòng)清洗三次，洗去表面粉塵，再放入超聲波清洗機(jī)中繼續(xù)清洗30 min，洗去殘余粉塵。清洗后的珠核放入沸水中煮40 min滅菌消毒，然后置于烘箱60 °C干燥。將處理好的珠核浸沒在不同濃度混合的藥液中，每隔10 min攪拌一次，常溫下浸泡30 min，取出，放于烘箱中烘干，即得包藥珠核。

1.3 外套膜插核手術(shù)

將育珠蚌刷洗干凈，放于清水池中10 h左右，讓母蚌排除體內(nèi)污泥和糞便等。將蚌體固定在手術(shù)臺(tái)上，用開殼器緩慢將蚌殼撐開約10 mm，加塞。用開口針在外套膜后端靠近腹緣處開口，口徑與深度以能放入一個(gè)珠核和一個(gè)細(xì)胞小片為宜。從小片貝上切下用來做細(xì)胞小片的外套膜，滴上紅藥水進(jìn)行殺菌，將外套膜去掉邊緣觸手，再切成長度約為0.8 mm的小片，用送針將干燥的珠核與黏在一起的細(xì)胞小片從開口處移植到育珠蚌體內(nèi)，每只育珠蚌植核30顆，兩側(cè)各15顆。術(shù)后將育珠蚌吊養(yǎng)在育珠水塘，育珠期8個(gè)月，每個(gè)星期檢查一次，去除死蚌。

1.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以黃芪生藥的濃度、黃霉素的濃度和土霉素的濃度為影響因素，以育珠蚌的成活率、留核率和優(yōu)質(zhì)珠率為指標(biāo)，安排實(shí)驗(yàn)。設(shè)一對(duì)照組，植入經(jīng)消毒干燥處理過的無藥珠核，重復(fù)3組，每組用蚌100只。實(shí)驗(yàn)組采用三因素四水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，黃芪生藥的濃度分別為0.9、1.2、1.5、1.8 g/mL，混合藥液中黃霉素的濃度分別為6、7.5、9、10.5 mg/mL，土霉素的濃度分別為7.5、9、10.5、12 mg/mL。實(shí)驗(yàn)組共16組，重復(fù)3組，每組用蚌100只。

1.5 數(shù)據(jù)的收集與處理

1.5.1 育珠蚌的成活率、留核率和優(yōu)質(zhì)珠率

育珠期結(jié)束后，分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組育珠蚌存活的數(shù)量、留核數(shù)以及優(yōu)質(zhì)珍珠數(shù)，按下列方法計(jì)算各組成活率、留核率和優(yōu)質(zhì)珠率。

育珠蚌的成活率=100%×育珠期結(jié)束后活蚌的總數(shù)量/育珠蚌的總數(shù)；

留核率=100%×成活的育珠蚌留核總數(shù)/成活的育珠蚌植核總數(shù)；

優(yōu)質(zhì)珠率=100%×優(yōu)質(zhì)珍珠數(shù)/收獲珍珠的總數(shù)。

優(yōu)質(zhì)珠的衡量標(biāo)準(zhǔn)具有多樣性，聘請(qǐng)經(jīng)驗(yàn)豐富的珍珠養(yǎng)殖專家以及權(quán)威機(jī)構(gòu)，對(duì)收獲的珍珠從光澤度、形狀、直徑、光潔度四個(gè)方面進(jìn)行品質(zhì)鑒定，選出優(yōu)質(zhì)珍珠。

1.5.2 基于熵權(quán)法的珍珠品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定

熵權(quán)法是基于信息學(xué)的理論，通過計(jì)算指標(biāo)的信息熵決定指標(biāo)的權(quán)重的一種客觀賦權(quán)法。指標(biāo)的變異性越大，所起的作用也越大，其權(quán)重也就越大。熵權(quán)法能夠消除信息之間的重疊性，深刻反映出指標(biāo)信息熵值的效用價(jià)值，具有較高的可信度和精確度。本實(shí)驗(yàn)先采用熵權(quán)法確定指標(biāo)存活率、留核率和優(yōu)質(zhì)珠率的權(quán)重分別記為，，，再按照式(1)將它們進(jìn)行線性加權(quán)合并為一個(gè)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

=++

(1)

1.6 遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化模型的建立

利用實(shí)驗(yàn)得到的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)，利用遺傳算法優(yōu)化隱層神經(jīng)元的個(gè)數(shù)和網(wǎng)絡(luò)權(quán)值，建立藥用珠核生產(chǎn)工藝的遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型，再用遺傳算法的全局尋優(yōu)功能，搜索最優(yōu)生產(chǎn)工藝組合。

1.6.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

因?qū)嶒?yàn)因素和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的量綱不同，因此在建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前，先對(duì)數(shù)據(jù)按公式(2)進(jìn)行歸一化處理，去除量綱和數(shù)量級(jí)對(duì)分析結(jié)果的影響，歸一化后的數(shù)據(jù)位均于[0,1]之間。

1.6.2 GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由輸入層、隱層和輸出層構(gòu)成，具有簡單、計(jì)算量小等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于訓(xùn)練開始時(shí)，系統(tǒng)中網(wǎng)絡(luò)權(quán)值、閾值、隱層神經(jīng)元的個(gè)數(shù)等參數(shù)的設(shè)置具有隨機(jī)性，易導(dǎo)致訓(xùn)練誤差增大或出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象。遺傳算法(Genetic Algorithm,GA)是一種基于自然選擇和種群遺傳機(jī)理的全局優(yōu)化搜索算法。通過模擬種群個(gè)體在遺傳過程中的選擇、雜交和突變，實(shí)現(xiàn)適者生存，從而找到最佳個(gè)體。

GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)先隨機(jī)生成一個(gè)初始權(quán)值種群，并對(duì)種群中的個(gè)體進(jìn)行二進(jìn)制編碼。然后，根據(jù)權(quán)值的適應(yīng)度值，用GA算法對(duì)權(quán)值進(jìn)行更新，淘汰劣的個(gè)體，留下優(yōu)的個(gè)體再組合成新一代種群，不斷重復(fù)上面的過程，逐步得到最優(yōu)解。GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法可以有效地提高預(yù)測(cè)的精度和處理問題的速度，縮短網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練時(shí)間。基于遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法搜尋包藥珠核最佳生產(chǎn)工藝條件的具體方案如下：

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)歸一化處理，為了提高網(wǎng)絡(luò)的收斂性和泛化能力，采用留一交叉驗(yàn)證方法，把所有正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)隨機(jī)分為訓(xùn)練集和測(cè)試集；設(shè)置遺傳算法運(yùn)行參數(shù)，利用遺傳算法優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)個(gè)體適應(yīng)度值，確定隱層神經(jīng)元的個(gè)數(shù)；利用遺傳算法優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)各層之間的權(quán)值。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值進(jìn)行編碼，并生成初始種群。根據(jù)個(gè)體適應(yīng)度值，不斷地運(yùn)行選擇、交叉和變異算子，生成新種群，直至滿足標(biāo)準(zhǔn)，得到最優(yōu)初始權(quán)值；再利用遺傳算法的全局尋優(yōu)功能，對(duì)得到的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)搜索最優(yōu)解，得到制作包藥珠核各藥物的最優(yōu)濃度組合。

利用Matlab14.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和分析，按照熵權(quán)法的步驟，計(jì)算育珠蚌的死亡率、留核率、優(yōu)質(zhì)珠率的權(quán)重和綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。設(shè)雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)<0.05，利用卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組、重復(fù)組之間的死亡率、留核率和優(yōu)質(zhì)珠率是否有顯著性差異。借助Matlab14.0工具箱，設(shè)計(jì)遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法程序，以黃芪生藥濃度、黃霉素濃度、土霉素濃度為輸入，以綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)為輸出，搜索包藥珠核藥物的最佳濃度。

2 結(jié)果

2019年，于浙江省諸暨市山下湖珍珠養(yǎng)殖基地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，育珠期為3-11月，期間日平均氣溫約為12.7～29.8 ℃。11月底，剖蚌取珠，分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和所有實(shí)驗(yàn)組存活蚌的總數(shù)、留核總數(shù)和優(yōu)質(zhì)珠總數(shù)。植入無藥珠核的對(duì)照組育珠蚌存活率為(85.0±2.6)%，留核率為(70.3±2.9)%，優(yōu)質(zhì)珠率為(60.6±2.4)%。

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案和結(jié)果

以黃芪藥液濃度、黃霉素濃度和土霉素濃度為因素，設(shè)計(jì)三因素四水平正交試驗(yàn)方案，各因素和水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

熵權(quán)法確定、和分別是0.352 0，0.271 7，0.376 3，根據(jù)公式(2)計(jì)算珍珠品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案、結(jié)果和綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)值見表2。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，16個(gè)實(shí)驗(yàn)組的育珠蚌存活率、留核率和優(yōu)質(zhì)珠率均明顯高于對(duì)照組，但3個(gè)重復(fù)組間無顯著性差異。

2.2 包藥珠核的最佳工藝條件的確定

以黃芪藥液濃度(g/mL)、黃霉素濃度(mg/mL)、土霉素濃度(mg/mL)為網(wǎng)絡(luò)輸入，以綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)為網(wǎng)絡(luò)輸出，建立GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，采用留一法將16組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分為測(cè)試集和驗(yàn)證集，所有變量經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用遺傳算法，對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，確定隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)和優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)權(quán)值，再對(duì)建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局尋優(yōu)，得到包藥珠核各藥物的的最佳濃度。

2.2.1 確定BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

設(shè)定初始種群的大小為20，隱含層為1層，訓(xùn)練的次數(shù)為20次，訓(xùn)練的適應(yīng)值為0.001。經(jīng)過訓(xùn)練，隱層神經(jīng)元的數(shù)量與平均訓(xùn)練誤差和平均預(yù)測(cè)誤差的關(guān)系如圖1所示。

圖1 神經(jīng)元的數(shù)量與絕對(duì)誤差

從圖1可以看出，隨著隱層神經(jīng)元數(shù)量的增加，雖然平均測(cè)試誤差不斷減小，但是當(dāng)神經(jīng)元數(shù)量為3時(shí)，平均驗(yàn)證誤差最小，之后逐漸增大，出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，因此取隱層神經(jīng)元的個(gè)數(shù)為3。以NMSE作為遺傳算法的適應(yīng)度值，對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，確定網(wǎng)絡(luò)權(quán)值和閾值，當(dāng)訓(xùn)練到15代時(shí)，訓(xùn)練集與驗(yàn)證集的最大絕對(duì)誤差為1.476，達(dá)到了預(yù)計(jì)值，擬合優(yōu)度=0.86。訓(xùn)練誤差和驗(yàn)證誤差如圖2(a)所示，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的關(guān)系如圖2(b)所示。

圖2 GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練與預(yù)測(cè)結(jié)果.

2.2.2 最優(yōu)生產(chǎn)工藝

基于上述建立好的GA-BP網(wǎng)絡(luò)模型，利用遺傳算法的全局尋優(yōu)功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)最優(yōu)生產(chǎn)工藝組合的自主搜索，得到包藥珠核混合的最佳藥物濃度:黃芪生藥濃度為1.55 g/mL，黃霉素藥液濃度為7.9 mg/mL，土霉素藥液濃度為9.48 mg/mL，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)可以達(dá)到94.49 %。

3 討論

3.1 包藥珠核規(guī)格對(duì)珍珠品質(zhì)的影響

本實(shí)驗(yàn)中所用到的珠核直徑均為2.5 mm，如果珠核的直徑變大，每只育珠蚌的植核數(shù)量將會(huì)減少，用于制作包藥珠核的最佳藥物濃度也會(huì)相應(yīng)地發(fā)生改變。以6 mm直徑珠核為例，如果按本實(shí)驗(yàn)中的最佳藥物濃度制作包藥珠核，育珠蚌的存活率和留核率大大降低，對(duì)育珠蚌解剖的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分珍珠囊破損，珠核脫落，其原因可能是大珠核附著的藥物比較多，黑化細(xì)胞小片并腐蝕珍珠囊壁，引起育珠蚌藥物中毒。因此對(duì)于不同規(guī)格的珠核，藥物的濃度也不一樣。

3.2 包藥珠核促進(jìn)育珠蚌傷口愈合

育珠蚌植入2.5 mm的普通珠核后，一般需要10 d左右傷口可以愈合，而植入同規(guī)格的包藥珠核后，傷口在3～5 d即可愈合。極大的降低了傷口感染致病菌的幾率，減少壞珠的數(shù)量，提高留核率。同時(shí)，中藥黃芪的益補(bǔ)作用可以更快地促進(jìn)育珠蚌珍珠質(zhì)的分泌，提高優(yōu)質(zhì)珠的數(shù)量，縮短育珠時(shí)間。

3.3 藥物濃度對(duì)珍珠品質(zhì)的影響

基于珍珠養(yǎng)殖戶長期養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)選取的藥物濃度范圍安全可靠，不會(huì)造成育珠蚌中毒死亡，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)也表明，在此濃度范圍內(nèi)，育珠蚌的存活數(shù)量并沒有明顯的變化。然而，留核率和優(yōu)質(zhì)珠率隨著黃芪濃度、黃霉素濃度和土霉素濃度的升高，表現(xiàn)出先增加后減小的特點(diǎn)。從對(duì)育珠蚌的解剖結(jié)果來看，過高的藥物濃度導(dǎo)致細(xì)胞小片黑化，腐蝕珍珠囊，增加脫核數(shù)。所以，優(yōu)化包藥珠核的藥物濃度對(duì)于提高珍珠的品質(zhì)十分重要。此外，中藥黃芪因產(chǎn)地、采收時(shí)間和貯藏條件的不同，藥效也會(huì)有所不同。因此在選取黃芪時(shí)，應(yīng)根據(jù)黃芪的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，盡量選取道地藥材。多項(xiàng)研究表明，山西的蒙古黃芪中黃芪甲苷、總黃酮、多糖的含量高于其他產(chǎn)地的黃芪，因此本實(shí)驗(yàn)選用了山西蒙古黃芪。

圖3 黃芪藥液濃度、黃霉素濃度、土霉素濃度與存活率、留核率、優(yōu)質(zhì)珠率的關(guān)系

3.5 外界環(huán)境對(duì)存活率、留核率及優(yōu)質(zhì)珠率的影響

育珠蚌的存活率、留核率及優(yōu)質(zhì)珠率與外界的氣候條件和育珠水域環(huán)境密不可分。水體的pH值，含菌量、養(yǎng)料的多少可以人為地進(jìn)行調(diào)控，但是水溫是不可控的因素之一，夏季的持續(xù)高溫或冬季的持續(xù)低溫，會(huì)增加育珠蚌的死亡率，并影響育珠蚌珍珠質(zhì)的分泌。育珠水域的生態(tài)環(huán)境也會(huì)影響到珍珠的養(yǎng)殖，近年來，廣大養(yǎng)殖戶積極探索魚蚌混養(yǎng)的生態(tài)養(yǎng)殖方式，魚類可以為蚌類提供豐富餌料，減少有機(jī)肥和化肥的施用；蚌類可以凈化水體，二者相容共生，不但降低了投資成本，提高社會(huì)效益和生態(tài)效益，也有利于促進(jìn)水域的健康和可持續(xù)性發(fā)展。