劉 飛，王 凡，鄭雅婷，李萌萌，冉娜娜，高曉楊，石亞男，朱娜娜，程惠敏，楊 瑞

(洛陽(yáng)師范學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471934)

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是一種鄰苯二甲酸型乙酰丙烯類的化學(xué)物質(zhì)。因其成本低廉、可塑性較強(qiáng)、相容性高、兼容效果好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用產(chǎn)品(醫(yī)療器材、一次性外科消毒手套等)、日常用品(玩具、雨衣等)中，來(lái)增強(qiáng)塑料制品的可塑性。DEHP通過(guò)范德瓦爾斯力或氫鍵與塑料分子形成不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此，它容易通過(guò)清洗等方式進(jìn)入空氣、水體或其他物質(zhì)之中。在高溫制作或者燃燒塑料制品過(guò)程中，DEHP由于蒸汽壓低也可通過(guò)煙塵等方式釋放到環(huán)境之中。隨著我國(guó)對(duì)DEHP這類鄰苯二甲酸類化學(xué)物質(zhì)重視程度加強(qiáng)，有關(guān)地表水中含有DEHP的研究被不斷報(bào)道出來(lái)。魚(yú)類處于水生捕食鏈中較高營(yíng)養(yǎng)級(jí)，并且終生生活在水中，極易受到水中環(huán)境污染物的影響，因此，開(kāi)展DEHP對(duì)魚(yú)類影響的研究是很有必要的。

斑馬魚(yú)()是一種與人類基因有著高度同源性，被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、病理學(xué)及藥理學(xué)研究中的理想模式生物。已有研究表明，DEHP對(duì)斑馬魚(yú)具有內(nèi)分泌、免疫、遺傳、肝臟等毒性。然而在魚(yú)類整個(gè)生命周期中，一般認(rèn)為魚(yú)的早期生命階段(從受精卵生長(zhǎng)發(fā)育至仔魚(yú)階段)是對(duì)外在污染物的干擾作用的最敏感階段，主要是由于這一階段的魚(yú)為補(bǔ)償因污染物干擾作用而引發(fā)體內(nèi)一系列生化反應(yīng)的能力與成魚(yú)相比較弱。目前發(fā)現(xiàn)DEHP對(duì)斑馬魚(yú)這一生命階段影響的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)DEHP可導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)發(fā)育畸形甚至死亡，干擾下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸從而致使甲狀腺激素升高。

DEHP與天然甲狀腺激素3,30,5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)的某些生理功能類似，其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素具有一定的相似性，所以，DEHP對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)干擾的影響深受關(guān)注。研究環(huán)境污染物對(duì)魚(yú)類內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響，主要研究其對(duì)魚(yú)類三條主要內(nèi)分泌軸[下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)、HPT軸]的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展DEHP斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)階段HPG軸和HPA軸的相關(guān)功能基因表達(dá)影響的研究，以期揭示其對(duì)斑馬魚(yú)內(nèi)分泌干擾的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚(yú)的繁殖

2月齡野生型斑馬魚(yú)經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖到5月齡性成熟后進(jìn)行繁殖。養(yǎng)殖期間，溫度保持在26～28 ℃，每天投喂3次新鮮孵化的豐年蟲(chóng)。斑馬魚(yú)的繁殖過(guò)程如下：選擇健康成熟的雄性和腹部膨大的雌性斑馬魚(yú)作為親本，繁殖前一晚將雌雄親本按1∶1放置在斑馬魚(yú)繁殖交配盒(上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)中，并用隔板隔開(kāi)，避光過(guò)夜。次日清晨開(kāi)燈并將隔板抽去。40 min后，吸出交配盒中雜質(zhì)，用魚(yú)卵撈網(wǎng)(上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)收集魚(yú)卵，放置于培養(yǎng)皿中，用海鹽水清洗胚胎，然后用體視顯微鏡觀察，剔除不正常的胚胎。將盛有胚胎的培養(yǎng)皿暴露于(27±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行胚胎暴露實(shí)驗(yàn)。

1.2 斑馬魚(yú)的胚胎毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前，用丙酮作為助溶劑將DEHP配制成高濃度的母液。實(shí)驗(yàn)中所用相應(yīng)濃度的暴露液由高濃度母液經(jīng)胚胎培養(yǎng)水稀釋而得，暴露液中的丙酮小于暴露液體積的0.01‰。DEHP暴露處理液的名義濃度依次為10、30和300 μg/L，對(duì)照組為0.01‰ 丙酮。使用150 mm的培養(yǎng)皿作為實(shí)驗(yàn)的暴露容器，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)生物學(xué)平行，每個(gè)培養(yǎng)皿加入50 mL暴露液，200枚發(fā)育正常的胚胎，然后再將其放在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，暴露實(shí)驗(yàn)期間用一次性吸管及時(shí)吸出停止發(fā)育或者死亡的胚胎和仔魚(yú)。在胚胎受精后96 h，吸除培養(yǎng)皿中雜質(zhì)，用專用魚(yú)苗撈網(wǎng)隨機(jī)撈取各培養(yǎng)皿中的仔魚(yú)50尾，吸干水分后，置于裝有RNA保存液(RNAlater)的EP管中，4 ℃過(guò)夜后再放置在-80 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。

1.3 斑馬魚(yú)仔魚(yú)的總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄

取出上述裝有斑馬魚(yú)仔魚(yú)樣品的EP管，待樣品解凍后，依據(jù)RNA提取試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)上的步驟提取各樣品中的總RNA，抽提完成后測(cè)定各樣品的/值，結(jié)果顯示均在1.8～2.0之間，同時(shí)，用凝膠電泳分析顯示28 S的亮度和寬度是18 S的2倍左右，表明RNA質(zhì)量較好。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒)中的步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)于濃度不在100～250 ng/μL的RNA樣品，在反轉(zhuǎn)錄之前用DNase/RNase-free ddHO進(jìn)行不同比例稀釋，然后用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，首先65 ℃預(yù)變性5 min，以提高后續(xù)反轉(zhuǎn)錄效率。將變性后的RNA樣品與5X RT Buffer、RT Enzyme Mix、Primer Mix和Nuclease-free Water配置成20 μL的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，混勻后放置于梯度PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.4 Real-Time PCR

斑馬魚(yú)β-actin(內(nèi)參)、HPG軸和HPA軸的相關(guān)功能基因(19、2、3、-、-和-基因；、、2、、和基因)的引物序列來(lái)自于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，詳見(jiàn)表1。

表1 PCR所用基因的引物序列

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(德國(guó)DBI生物科技公司)中操作步驟，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣本與相應(yīng)基因上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mastermix和無(wú)菌ddHO配成20 μL的RT-qPCR反應(yīng)體系，混勻后，放到實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中對(duì)各基因進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用2法對(duì)RT-qPCR反應(yīng)后獲得的Cq值進(jìn)行分析，運(yùn)用Excel 2016分析計(jì)算各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。然后再利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，并用最小顯著差數(shù)法(LSD法)分析對(duì)照組和處理組之間的差異。若<0.05，則表示差異顯著；<0.01，則表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEHP對(duì)斑馬魚(yú)早期發(fā)育階段HPG軸相關(guān)基因表達(dá)的影響

DEHP對(duì)斑馬魚(yú)早期生命階段生殖軸的相關(guān)功能基因(19、2、3、-、-和-基因)表達(dá)影響的RT-qPCR結(jié)果見(jiàn)圖1。與垂體相關(guān)的芳香化酶基因19、下丘腦相關(guān)的促性腺激素釋放激素基因3、垂體相關(guān)的雌激素受體基因-和-在DEHP質(zhì)量濃度為30 μg/L時(shí)表達(dá)量顯著升高，依次升高了116%、191%、132%和267%；下丘腦相關(guān)的促性腺激素釋放激素基因2在各DEHP處理組表達(dá)量顯著升高，依次升高了82%，208%和91%。垂體中的卵泡刺激素基因-在各DEHP處理組表達(dá)量無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，DEHP顯著升高了斑馬魚(yú)早期生命階段HPG軸的相關(guān)功能基因的表達(dá)。

圖1 DEHP對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)HPG軸的相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=5)

2.2 DEHP對(duì)斑馬魚(yú)早期發(fā)育階段HPA軸相關(guān)基因表達(dá)的影響

DEHP對(duì)斑馬魚(yú)早期生命階段腎上腺軸的相關(guān)功能基因(、、2、、和基因)表達(dá)影響的RT-qPCR結(jié)果見(jiàn)2。HPA軸的相關(guān)功能基因(基因除外)在各DEHP處理組表達(dá)量顯著降低，其中，下丘腦和垂體相關(guān)的阿黑皮素原基因依次降低了68%、68%和55%，垂體中鹽皮質(zhì)激素受體基因依次降低了75%、78%和57%，腎上腺中的黑素腎上腺皮質(zhì)激素2受體基因2依次降低了46%、79%和55%，下丘腦中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素基因依次降低了76%、82%和65%，垂體中的糖皮質(zhì)激素受體基因依次降低了52%、54%和72%。垂體中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結(jié)合蛋白基因在各DEHP處理組表達(dá)量無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，DEHP顯著降低了斑馬魚(yú)早期生命階段HPA軸的相關(guān)功能基因的表達(dá)。

圖2 DEHP對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)HPA軸的相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=5)

3 討論

魚(yú)類生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控主要就是通過(guò)魚(yú)類的HPG軸完成，主要過(guò)程為：首先由下丘腦依據(jù)機(jī)體生理功能的需要釋放不同類型的促性腺激素釋放激素(GnRHs)作用于魚(yú)類的垂體的相應(yīng)部位上，后者通過(guò)合成并釋放促性腺激素(GTH)作用于性腺，進(jìn)而有效調(diào)控魚(yú)類的生殖。魚(yú)類的促性腺激素依據(jù)功能的不同又可分為促黃體素(LH)和促卵泡激素(FSH)。19、-和-是生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)中性激素合成相關(guān)功能基因，主要是在性腺和腦中表達(dá)。由于DEHP代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素具有一定的相似性，因此，通過(guò)測(cè)定HPG軸的相關(guān)功能基因表達(dá)量可探討DEHP對(duì)斑馬魚(yú)早期生命階段生殖內(nèi)分泌干擾的分子機(jī)制。

2和3是促性腺激素釋放激素家族中的重要成員，其中3僅魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)。2和3對(duì)魚(yú)類生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)起重要作用，其靶器官為垂體，通過(guò)2和3的合成與釋放來(lái)調(diào)控垂體中FSH和LH的合成與釋放，進(jìn)而抑制或促進(jìn)性腺激素的合成與釋放。本研究中，DEHP處理組的2和3表達(dá)量上升，這可能會(huì)導(dǎo)致性激素的合成發(fā)生改變。19是芳香化酶，是細(xì)胞色素p450中的一種，在魚(yú)類生殖內(nèi)分系統(tǒng)中主要作用是催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，在雌激素的合成中起到關(guān)鍵作用。在本研究中，與對(duì)照組相比，30 μg/LDEHP處理組19表達(dá)量顯著性升高，這可能會(huì)導(dǎo)致E2/11KT比例增加。ERs是與雌激素特異性結(jié)合的受體分子，二者的結(jié)合是雌激素生理作用發(fā)揮的前提，進(jìn)而調(diào)控生物體生殖等生理過(guò)程。本研究中，-和-的表達(dá)量在30 μg/LDEHP處理組顯著性升高，進(jìn)一步表明了DEHP能夠?qū)е掳唏R魚(yú)胚胎/仔魚(yú)E2/11KT比例增加。另有研究表明，HPG軸和HPT軸間存在著交互作用，賈盼盼的研究報(bào)道了DEHP增加了斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)HPT軸和TH濃度相關(guān)基因的表達(dá)。因此，DEHP也有可能通過(guò)HPT軸間接作用于HPG軸從而導(dǎo)致HPG軸的相關(guān)功能基因的表達(dá)。以上這些結(jié)果表明，DEHP不僅可以直接作用于斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)的HPG軸，也可間接作用于HPG軸，影響其相關(guān)功能基因的表達(dá)，從而干擾魚(yú)類的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)。

HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，下丘腦受到刺激會(huì)分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Crh)，Crh可以誘導(dǎo)垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(Acth)，進(jìn)而作用于腎上腺皮質(zhì)合成糖皮質(zhì)激素(主要是皮質(zhì)醇)；Crh還可促使Acth的前體阿黑皮素原(Pomc)水解。Acth也可作用于黑素腎上腺皮質(zhì)激素2受體(Mc2r)，加速腎上腺糖皮質(zhì)激素的合成和分泌。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結(jié)合蛋白(Crhbp)能夠與Crh結(jié)合使其失活，從而影響機(jī)體的內(nèi)分泌。鹽皮質(zhì)激素受體基因()和糖皮質(zhì)激素受體基因()都屬于類醇激素受體,是HPA軸負(fù)反饋的主要調(diào)控者。目前，關(guān)于DEHP對(duì)斑馬魚(yú)HPA軸的影響的研究尚未被報(bào)道。本研究中，斑馬魚(yú)胚胎暴露于DEHP 4 d之后，、、、2和基因表達(dá)水平在DEHP處理組顯著降低，說(shuō)明在DEHP的刺激下，斑馬魚(yú)下丘腦基因的表達(dá)量下降，其誘導(dǎo)垂體釋放的Acth下降，同時(shí)，的下降也促使Acth的前體Pomc水解，進(jìn)而反饋于Pomc，使基因轉(zhuǎn)錄水平下降。另外，下降的Acth調(diào)節(jié)Mc2r的合成，致使2基因表達(dá)的降低，進(jìn)而影響腎上腺糖皮質(zhì)激素的合成和分泌。DEHP的刺激也抑制了斑馬魚(yú)和基因的表達(dá)量，下降的和也會(huì)負(fù)反饋調(diào)控HPA軸。有研究顯示，化學(xué)物質(zhì)可以通過(guò)降低斑馬魚(yú)體內(nèi)E2的濃度來(lái)降低皮質(zhì)激素的濃度，而本研究的結(jié)果顯示DEHP可能會(huì)增加斑馬魚(yú)體內(nèi)的E2的濃度，這表明DEHP對(duì)斑馬魚(yú)早期生命階段的HPA軸的影響并沒(méi)有通過(guò)對(duì)HPG軸的影響而間接作用于HPA軸，可能是通過(guò)直接作用于HPA軸而引起的。

4 結(jié)論

通過(guò)DEHP對(duì)斑馬魚(yú)的胚胎/仔魚(yú)階段的暴露實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DEHP導(dǎo)致HPG軸上相關(guān)基因顯著上調(diào)，HPA軸上相關(guān)基因顯著下調(diào)。這表明DEHP對(duì)斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)階段的2個(gè)主要內(nèi)分泌分子通路的影響將會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌功能的改變，從而可能影響斑馬魚(yú)的后期生長(zhǎng)發(fā)育。