余少梅，高銀愛(ài)，魏朝輝,，周裕和,，羅楊志，董 軍，張立強(qiáng),，鄧 平,，胡亦清，鄭程鵬,，喻運(yùn)珍,

(1.武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司，武漢 430207；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430207)

姜黃素具有抗炎、抗微生物、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等多方面的藥理作用，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。近年來(lái)，姜黃素在水產(chǎn)上應(yīng)用的研究逐漸增多，研究表明姜黃素可以顯著提高黃顙魚(yú)()的生長(zhǎng)性能、消化能力以及抗氧化能力；提高大菱鲆幼魚(yú)的血清抗氧化能力；對(duì)水產(chǎn)主要致病菌嗜水氣單胞菌()、鰻弧菌()、遲緩愛(ài)德華氏菌()具有一定的抑菌作用；能促進(jìn)尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的提高，可有效地抑制誘導(dǎo)的魚(yú)肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化；對(duì)誘導(dǎo)的草魚(yú)肝損傷具有保護(hù)作用，由此可見(jiàn)姜黃素具有開(kāi)發(fā)為水產(chǎn)用藥的潛力。目前姜黃素在大鼠()、小鼠()、家兔()、人()上均有藥代動(dòng)力學(xué)的相關(guān)研究，但是關(guān)于其在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究卻很少見(jiàn)。姜黃提取散是由姜黃醇提物加輔料制備而成，其主要活性成分為姜黃素，應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物保肝護(hù)肝。本研究考察了姜黃提取散口灌給藥后，姜黃素在草魚(yú)()體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及組織中分布規(guī)律，以期為姜黃提取散臨床用藥方案的制定提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)也彌補(bǔ)了姜黃素在草魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)這一研究空白，為姜黃素水產(chǎn)用相關(guān)制劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

草魚(yú)來(lái)自武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院江夏山坡基地，體質(zhì)量(104.37±22.06)g，實(shí)驗(yàn)前在水族箱中暫養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣48 h自來(lái)水，連續(xù)充氧，保持水中溶氧大于5.0 mg/L，水溫(25±1)℃，pH值7.5～8.0，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中停食。

1.1.2 試驗(yàn)藥物與試劑

姜黃提取散(姜黃素含量為10%，由本實(shí)驗(yàn)室制備)；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；姜黃素-D6(純度≥99.5%，加拿大Toronto Research Chemicals)；肝素鈉(>99%，上海索萊寶生物科技有限公司)；乙腈、正己烷(色譜純，F(xiàn)isher ChemAlert公司)；冰醋酸、甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解定容，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

內(nèi)標(biāo)(姜黃素-D6)儲(chǔ)備液：精確稱取姜黃素-D6標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解定容，配制成12 μg/mL儲(chǔ)備液。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

氮吹儀(AGC-12D，天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；旋渦混合器(QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源(ESI)(Waters)；分析天平(JH502，江蘇三愛(ài)思科學(xué)儀器有限公司)；冷凍離心機(jī)(CR21N，日立)；可調(diào)高速勻漿機(jī)(FSH-2，常州智博瑞儀器制造有限公司)。

1.2 給藥與采樣

姜黃提取散用少許乙醇溶解后用蒸餾水稀釋至20 mg/mL(以姜黃素計(jì))混懸液。按100 mg/kg魚(yú)體重(以姜黃素計(jì)，下同)，即50 μL/10 g魚(yú)體重單次給藥，將藥物用1 mL注射器接硅膠軟管從草魚(yú)口中注入，注意深度，無(wú)回吐魚(yú)可用于實(shí)驗(yàn)。

分別于給藥后20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、17 h、24 h、48 h，草魚(yú)尾靜脈取血，1%肝素鈉抗凝后4 000 r/min離心10 min，取上清；同時(shí)解剖分離出肌肉、皮、肝臟、腎臟；以上樣品于-20 ℃下冷凍保存。

每一時(shí)間點(diǎn)各取5尾魚(yú)，作為5個(gè)平行樣品分別處理測(cè)定。另取5尾未給藥魚(yú)作空白對(duì)照。

1.3 樣品處理

樣品處理參照劉永濤等方法，略作調(diào)整。

1.3.1 血漿樣品

樣品在室溫下自然解凍，搖勻后移取0.5 mL血漿樣品于15 mL離心管中，加入100 μL姜黃素-D6溶液(250 μg/L)，加入4.5 mL乙腈(0.01%冰醋酸)，渦旋30 s，4 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移提取液至另一10 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，置于氮吹儀45 ℃吹至干，用1 mL 75%乙腈溶解殘?jiān)?，溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，15 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.2 組織樣品

樣品在室溫下自然解凍，準(zhǔn)確稱取2 g肌肉，或0.5 g魚(yú)皮、肝臟或腎臟樣品于15 mL離心管中，加入100 μL姜黃素-D6溶液(250 μg/L)，加入5 mL乙腈(0.01%冰醋酸)，勻漿30 s，4 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移提取液至10 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，置于氮吹儀45 ℃吹至干，用1 mL 75%乙腈溶解殘?jiān)?，再加?.5 mL正己烷，渦旋30 s，4 000 r/min離心10 min，棄去上層正己烷層，溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，15 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.4 檢測(cè)方法建立

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18 2.5 μm，2.1×50 mm；流動(dòng)相A：10 mmol/L甲酸銨溶液(0.1%甲酸)；流動(dòng)相B：乙腈(0.1%甲酸)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫程序，7.5 min，見(jiàn)表1。

表1 洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧(ESI)；掃描極性：正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：150 L/h；碰撞氣流速：0.13 mL/min；質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)離子對(duì)：見(jiàn)表2。

表2 檢測(cè)離子對(duì)

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精確量取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)液，用空白基質(zhì)定容，配制成姜黃素濃度分別為0.05、0.50、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L，姜黃素-D6均為250.00 μg/L的濃度。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液相色譜-質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析測(cè)定，記錄色譜峰面積。以姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)()，以姜黃素和姜黃素-D6響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)()，進(jìn)行線性回歸，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。用空白組織制成低質(zhì)量濃度藥物的含藥組織，經(jīng)預(yù)處理后測(cè)定，將引起三倍基線噪音的藥物的質(zhì)量濃度定義為最低檢測(cè)限。

1.4.4 回收率和精密度測(cè)定

分別在草魚(yú)空白血漿、肌肉、肝臟、腎臟、皮中加入姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，使姜黃素質(zhì)量濃度()為0.05、5.00、50.00 μg/kg，每個(gè)濃度3個(gè)平行，按樣品處理方法處理后測(cè)定，得到三個(gè)濃度水平的測(cè)定值()，回收率=/×100%。每個(gè)濃度的樣品，于同1 d不同時(shí)間段連續(xù)測(cè)定 3 次，計(jì)算得日內(nèi)精密度；1周內(nèi)重復(fù)測(cè)3次，計(jì)算得日間精密度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)給藥后各時(shí)間點(diǎn)姜黃素的血藥濃度繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)用藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件(WinNonlin5.2.1)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品色譜圖

圖1是不同魚(yú)體組織中陽(yáng)性樣品的色譜圖。不同組織中測(cè)定峰均不受組織基質(zhì)影響，峰型尖銳，雜峰少。

圖1 不同草魚(yú)組織樣品中姜黃素色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：=1 2042+4983，=0.999 1，在0.05～50.00 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，血漿中姜黃素檢測(cè)限為0.02 μg/L，魚(yú)肉、魚(yú)皮、腎臟、肝臟中檢測(cè)限為0.02 μg/kg。

2.3 方法回收率與精密度

經(jīng)測(cè)定，血漿、魚(yú)肉、肝臟、腎臟、魚(yú)皮三個(gè)質(zhì)量濃度水平下平均回收率分別為97.13%～104.07%、97.4%～101.97%、78.73%～85.2%、77.16%～88.53%、95.07%～106.10%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%～4.85%、3.36～6.12%、3.00%～7.48%、3.94%～6.95%、1.93%～9.83%。

日內(nèi)精密度分別為0.86%～3.35%、1.23%～5.35%、3.23%～7.14%、2.39%～6.25%、0.96%～5.67%、日間精密度分別為3.04%～9.05%、2.35%～8.54%、1.37%～7.85%、1.54%～7.62%、4.68%～9.62%，日內(nèi)、日間誤差均小于10%。

2.4 姜黃素在血液中藥代動(dòng)力學(xué)

草魚(yú)100 mg/kg單劑量口灌姜黃提取散后，血漿中姜黃素濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，經(jīng)WinNonlin5.2.1非房室模型分析得到的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。給藥后8 h，姜黃素在血液中達(dá)到峰值，峰濃度為0.406 μg/L，消除半衰期為21.596 h，姜黃素在草魚(yú)血液中達(dá)峰時(shí)間長(zhǎng)，峰濃度低，體內(nèi)消除快。表觀分布容積為377 795.553 L/kg，大于1.00 L/kg，說(shuō)明姜黃素在組織中的分布濃度大于血漿，在組織中分布廣泛(Vz_F_obs：0.80～1.00 L/kg，藥物在體內(nèi)均勻分布；>1.00 L/kg，組織中的藥物濃度大于血漿)。

圖2 草魚(yú)口灌單劑量姜黃提取散后血藥濃度時(shí)間曲線

表3 姜黃素在草魚(yú)體內(nèi)主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.5 姜黃素在組織中分布情況

草魚(yú)口灌姜黃提取散后，姜黃素在魚(yú)肉、魚(yú)皮、肝臟、腎臟中均有分布，濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在2 h和24 h分別出現(xiàn)峰值(圖3)。8 h前，同一時(shí)間點(diǎn)姜黃素濃度肝臟>腎臟>魚(yú)皮>魚(yú)肉，8 h后腎臟>肝臟>魚(yú)皮>魚(yú)肉。姜黃素體內(nèi)最大峰濃度分別如下，血漿0.406 μg/L，肉11.32 μg/kg，皮52.68 μg/kg，腎臟139.78 μg/kg，肝臟190.02 μg/kg。姜黃素在肝臟和腎臟中分布較多，血漿、肉和皮中分布較少。

圖3 草魚(yú)組織中姜黃素濃度時(shí)間曲線

3 討論

3.1 草魚(yú)組織中姜黃素檢測(cè)方法建立

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)草魚(yú)口灌姜黃提取散后，組織中姜黃素含量較低，當(dāng)用高效液相色譜檢測(cè)時(shí)，組織中低濃度的姜黃素難以檢測(cè)出來(lái)，故選擇液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)優(yōu)化該方法在血漿中檢測(cè)限可達(dá)0.02 μg/L，魚(yú)皮、魚(yú)肉、肝臟和腎臟中檢測(cè)限可達(dá)0.02 μg/kg，優(yōu)于超高效液相色譜法(檢測(cè)限是0.010 mg/kg)。比較了梯度洗脫和等度洗脫，1 μg/L和10 μg/L姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在梯度洗脫條件下，峰型和響應(yīng)度均較好，因此選擇梯度洗脫方式。在采用外標(biāo)法檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟組織加標(biāo)回收率只有51.4%～68.3%，考慮到樣品處理過(guò)程中操作較多，會(huì)引起操作誤差，故在樣品中加入同位素標(biāo)記的姜黃素-D6作為內(nèi)標(biāo)，經(jīng)考察確定樣品中加入量為25 ng時(shí)，內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值和峰型均可達(dá)到檢測(cè)需求，最終建立方法的加標(biāo)回收率可達(dá)77.16%～106.10%。該方法回收率高、重復(fù)性好、靈敏度高，能夠滿足草魚(yú)組織樣品中姜黃素含量的測(cè)定。

3.2 姜黃素在草魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征及組織分布

達(dá)峰時(shí)間()是衡量藥物在體內(nèi)吸收速度的重要參數(shù)之一，消除半衰期()是反映機(jī)體對(duì)藥物消除速率的一個(gè)重要參數(shù)。草魚(yú)單劑量口灌100 mg/kg姜黃提取散后，姜黃素在血漿中達(dá)峰時(shí)間為8 h，峰濃度為0.406 μg/L，消除半衰期為21.596 h；張立康等給大鼠灌胃200 mg/kg姜黃素，達(dá)峰時(shí)間為32 min，峰濃度為0.7 mg/L，消除半衰期為90.79 min；趙自明等給家兔灌服復(fù)方姜黃素片，血藥濃度分別在20 min和45 min達(dá)到峰值，最大濃度為6.1 ng/mL，消除半衰期為25.07 h。可以看出，同為口灌給藥，姜黃素在草魚(yú)體內(nèi)吸收較大鼠、家兔緩慢，達(dá)峰時(shí)間長(zhǎng)，峰濃度低，消除較大鼠慢，較家兔快。而同為大鼠給藥，得到的結(jié)果也不相同。姜黃素在草魚(yú)、大鼠血液中只有一個(gè)峰值，而在家兔血液中呈現(xiàn)兩個(gè)峰值。這些藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程的差異可能與給藥對(duì)象種屬、給藥濃度、給藥劑型等均有關(guān)系。

姜黃素血漿峰濃度較低，表明姜黃素吸收入血的量很少，這一點(diǎn)從偏高的表觀分布容積也可以看出。表觀分布容積是反映藥物在體內(nèi)分布情況的重要的物理量。當(dāng)>1.00 L/kg，表示藥物集中分布在某個(gè)器官或大范圍組織內(nèi)。本研究中姜黃素在草魚(yú)體內(nèi)表觀分布容積為377 795.553 L/kg，極大于1.00 L/kg，推測(cè)一種可能是灌胃后，部分藥物未被吸收，直接通過(guò)胃腸道排出，進(jìn)入血液中姜黃素含量低，導(dǎo)致計(jì)算得到的表觀分布容積偏高。同理，計(jì)算得到的總體清除率也較大。另一種可能是體內(nèi)姜黃素集中于某一器官或組織中，具體為哪種有待進(jìn)一步研究。

草魚(yú)血液中姜黃素達(dá)峰時(shí)間晚于其它組織，且峰值也比其它組織中低，推測(cè)進(jìn)入血液中的姜黃素會(huì)迅速分布到其它組織，劉玉林等在諾氟沙星在大黃魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究中得到相似結(jié)果。姜黃素在肝臟、腎臟、魚(yú)皮、魚(yú)肉中分布呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，可能與口服藥物的肝腸循環(huán)、胃腸道多位點(diǎn)吸收、藥物制劑等有關(guān)。腎臟和肝臟中濃度高于魚(yú)肉和魚(yú)皮，這可能是因?yàn)楦闻K和腎臟是負(fù)責(zé)將藥物從機(jī)體里清除的器官；并且肝臟和腎臟滲透性好且含豐富的血管，所以藥物比在滲透性差、血管貧乏的肌肉和皮中分布的多。秦方錦等認(rèn)為組織器官結(jié)構(gòu)和功能的不同，對(duì)藥物的處置也各不相同，使其對(duì)藥物的代謝及分布具有明顯的組織特異性。多個(gè)研究表明姜黃素具有保肝護(hù)肝作用，能夠抗炎、抗脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷；抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和活化，誘導(dǎo)其凋亡，阻止肝纖維化發(fā)生。作為姜黃素的靶器官之一，用藥后試驗(yàn)草魚(yú)肝臟中姜黃素含量最高，這恰好有利于姜黃素保肝護(hù)肝作用的發(fā)揮。另外，魚(yú)皮中姜黃素含量相對(duì)較高，同一時(shí)間點(diǎn)均高于魚(yú)肉。喻鵬飛等研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)水產(chǎn)致病菌嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌均具有抑制作用。魚(yú)皮對(duì)姜黃素的吸附提示，對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物體表細(xì)菌引起的病灶，能否采用浸泡給藥的方式予以治療，有待進(jìn)一步研究。