陳忠銳

【摘要】 目的：研究川牛膝多糖在病毒性心肌炎心肌細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。方法：利用柯薩奇病毒B3（CVB3）誘導(dǎo)SD大鼠原代心肌細(xì)胞，構(gòu)建病毒性心肌炎模型，并給予不同濃度的川牛膝多糖。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測心肌細(xì)胞活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase-3）、Sema7A蛋白表達(dá)，試劑盒檢測丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性，實時熒光定量PCR（qPCR）檢測Sema7A mRNA表達(dá)。在心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-Sema7A，同時進(jìn)行CVB3處理，觀察抑制Sema7A表達(dá)對CVB3感染心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響。在心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sema7A過表達(dá)載體（pcDNA Sema7A），同時進(jìn)行CVB3和川牛膝多糖處理，探討過表達(dá)Sema7A對川牛膝多糖作用的CVB3感染心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響。結(jié)果：與空白組比較，CVB3顯著增加心肌細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量、MDA含量、Sema7A mRNA和Sema7A蛋白表達(dá)量（P<0.05），明顯降低SOD、CAT活性（P<0.05）。與CVB3組比較，20、40、80、160 μg/mL的川牛膝多糖顯著減少CVB3感染心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量（P<0.05），并且80 μg/mL川牛膝多糖明顯降低MDA含量、Sema7A mRNA和蛋白表達(dá)量，顯著提高SOD、CAT活性（P<0.05）。抑制Sema7A表達(dá)明顯減少CVB3感染心肌細(xì)胞中Sema7A mRNA及蛋白表達(dá)量、MDA含量、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率（P<0.05），提升SOD活性、CAT活性（P<0.05）。過表達(dá)Sema7A逆轉(zhuǎn)了川牛膝多糖對CVB3感染心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的抑制作用。結(jié)論：川牛膝多糖可能通過調(diào)控Sema7A表達(dá)，保護(hù)病毒性心肌炎心肌細(xì)胞損傷并抑制細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 川牛膝多糖 Sema7A 病毒性心肌炎 細(xì)胞凋亡

[Abstract] Objective： To study the role and mechanism of polysaccharide from Cyathulae officinalis Kuan in myocardial cell injury and apoptosis of viral myocarditis. Method： CVB3 was used to induce primary cardiomyocytes of SD rats to construct a model of viral myocarditis， and different concentrations of polysaccharides from Cyathulae officinalis Kuan were administered. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis， Western blot was applied to analyze the expression of cleaved caspase-3 and Sema7A in cardiomyocytes， the kit detected MDA content， SOD activity and CAT activity， and qPCR determined Sema7A mRNA expression. si-Sema7A was transfected into cardiomyocytes and treated with CVB3 to observe the effect of inhibiting the expression of Sema7A on apoptosis and oxidative damage of CVB3-infected cardiomyocytes; Sema7A overexpression vector （pcDNA Sema7A） was transfected into cardiomyocytes， and CVB3 and polysaccharides from Cyathulae officinalis Kuan were treated simultaneously to investigate the effects of overexpression of Sema7A on apoptosis and oxidative damage of cardiomyocytes infected by CVB3. Result： Compared with the blank group， CVB3 obviously increased myocardial apoptosis rate， cleaved caspase-3 protein expression， MDA content， Sema7A mRNA and Sema7A protein expression （P<0.05）， and significantly decreased SOD and CAT activities （P<0.05）. Compared with the CVB3 group， 20， 40， 80， 160 μg/mL of polysaccharide from Cyathulae officinalis Kuan greatly reduced the apoptosis rate of CVB3-infected cardiomyocytes and the expression of cleaved caspase-3 protein （P<0.05）， and 80 μg/mL polysaccharide from Cyathulae officinalis Kuan evidently decreased MDA content， Sema7A mRNA and protein expression， while markedly increased SOD and CAT activities （P<0.05）. Inhibition of Sema7A expression remarkably reduced Sema7A mRNA and protein expression， MDA content， cleaved caspase-3 protein expression， apoptosis rate （P<0.05）， and improved SOD activity and CAT activity in CVB3-infected cardiomyocytes （P<0.05）. Overexpression of Sema7A reversed the inhibitory effects of polysaccharides from Cyathulae officinalis Kuan on apoptosis and oxidative damage of cardiomyocytes infected with CVB3. Conclusion： Polysaccharide from Cyathulae officinalis Kuan protects the cardiomyocytes of viral myocarditis and inhibits apoptosis by regulating the expression of Sema7A.

[Key words] Polysaccharide from Cyathulae officinalis Kuan Sema7A Viral myocarditis Apoptosis

First-author’s address： Benxi Central Hospital， Liaoning Province， Benxi 117000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.03.008

病毒性心肌炎是最常見的心肌炎類型，常伴有心源性猝死和慢性擴(kuò)張性心肌病，年輕人尤為常見[1]。病毒性心肌炎相關(guān)病毒主要包括腸道和上呼吸道感染病毒，其中最常見的是柯薩奇病毒B3（CVB3）[2]。由于對該疾病的分子機(jī)制了解有限，缺乏對病毒性心肌炎的有效治療策略。因此，闡明病毒性心肌炎的分子機(jī)制對于理解和治療心肌病非常關(guān)鍵。川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，具逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋之功，用于經(jīng)閉癥瘕，胞衣不下，跌撲損傷，風(fēng)濕痹痛，足痿筋攣，尿血血淋[3]。川牛膝多糖是中藥川牛膝的藥效成分之一，川牛膝多糖具有一定的抗氧化能力[4]，可以保護(hù)H2O2刺激的PC12細(xì)胞氧化損傷，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性而增強(qiáng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，并減少細(xì)胞凋亡[5]，也可明顯減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠機(jī)體氧化應(yīng)激，效果與維生素C相當(dāng)[6]。然而對于川牛膝多糖在病毒性心肌炎中的作用鮮有報道。Semaphorin 7A（Sema7A）在神經(jīng)軸突生長、腫瘤抑制以及各種炎癥相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎模型中，Sema7A上調(diào)表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)顯著緩解小鼠病毒性心肌炎癥狀，表明Sema7A在病毒性心肌炎發(fā)病進(jìn)程中扮演著重要角色[7]?；诖?，本研究利用CVB3損傷SD大鼠原代心肌細(xì)胞，復(fù)制病毒性心肌炎模型，評價川牛膝多糖對心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響，并結(jié)合Sema7A基因探索其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 SD大鼠（SPF級）購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，川牛膝購自北京市藥材公司，CVB3購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、MDA、SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，RIPA裂解液購自美國Sigma公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3）、Sema7A、β肌動蛋白（β-actin）抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Millipore公司，Tris-HCl-Tween緩沖液（Tris buffered saline with Tween，TBST）購自上海生工生物工程公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，Lipofectamine 2000、TRIzol購自美國Invitrogen公司，小干擾RNA陰性對照（si-con）、Sema7A小干擾RNA（si-Sema7A）、過表達(dá)空載體pcDNA、Sema7A過表達(dá)載體（pcDNA Sema7A）購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.2 川牛膝多糖制備 川牛膝飲片粉碎，取藥材粉末，采用水提醇沉法提取川牛膝多糖[6，8]，大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，經(jīng)濃縮、干燥，得到川牛膝多糖，多糖提取率為4.52%。

1.3 細(xì)胞分離、培養(yǎng)與分組 取出生2～3 d的SD大鼠心室，參考劉真等[9]方法進(jìn)行原代心肌細(xì)胞的分離，用0.05%的胰酶消化，再用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化，結(jié)合差速貼壁純化心肌細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶用于抑制成纖維細(xì)胞增殖，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取72 h后的單層細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。將心肌細(xì)胞（1×105）隨機(jī)分為空白組（無任何處理的心肌細(xì)胞），CVB3組（模型組，使用CVB3處理心肌細(xì)胞），CVB3+川牛膝多糖20 μg/mL組（使用CVB3、20 μg/mL川牛膝多糖處理心肌細(xì)胞），CVB3+川牛膝多糖40 μg/mL組（使用CVB3、40 μg/mL川牛膝多糖處理心肌細(xì)胞），CVB3+川牛膝多糖80 μg/mL組（使用CVB3、80 μg/mL川牛膝多糖處理心肌細(xì)胞），CVB3+川牛膝多糖160 μg/mL組（使用CVB3、160 μg/mL川牛膝多糖處理心肌細(xì)胞）。其中，心肌炎細(xì)胞模型（CVB3感染心肌細(xì)胞）建立參考常欣等[10]方法，共處理7 d。獨立重復(fù)實驗3次，每個重復(fù)有3個復(fù)孔。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡檢測按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明進(jìn)行。收集5×105個心肌細(xì)胞，加入Annexin V-FITC結(jié)合液195 μL，使細(xì)胞重懸，加入Annexin V-FITC 5 μL，輕輕混勻。加入碘化丙啶染色液10 μL，輕輕混勻。在室溫條件下避光孵育10 min，檢測心肌細(xì)胞凋亡。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測心肌細(xì)胞cleaved caspase-3、Sema7A蛋白表達(dá) 在心肌細(xì)胞中加入RIPA裂解液，以提取蛋白。蛋白置沸水變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜，在5%脫脂奶粉中封閉1 h。加入cleaved caspase-3、Sema7A蛋白（稀釋度1︰1 000）一抗，同時加入內(nèi)參蛋白β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。使用TBST溶液洗膜15 min，重復(fù)3次，加入二抗（稀釋度1︰5 000），室溫中孵育1 h，TBST溶液洗膜15 min，重復(fù)3次，顯色顯影，分析cleaved caspase-3、Sema7A蛋白表達(dá)。

1.6 MDA含量、SOD活性和CAT活性測定 心肌細(xì)胞經(jīng)不同處理后，取200 μL上清液，按照各自試劑盒說明書的指示，評估細(xì)胞中MDA含量、SOD活性和CAT活性。

1.7 實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）檢測Sema7A mRNA表達(dá) 為檢測心肌細(xì)胞中Sema7A mRNA水平，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，之后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。Sema7A正向引物序列5’-TACCAGGGTCTATGGCGTTTTC-3’，反向引物序列5’-GCCCATGTGGTAGCCTTTGA-3’。收集Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法分析Sema7A mRNA相對表達(dá)量。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 調(diào)整心肌細(xì)胞密度為1×105個/mL，將其接種至6孔板，心肌細(xì)胞融合至70%時，利用Lipofectamine 2000試劑，將si-con、si-Sema7A、pcDNA、pcDNA Sema7A轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞，培養(yǎng)備用。根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，將轉(zhuǎn)染si-con、si-Sema7A的心肌細(xì)胞使用CVB3處理，轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA Sema7A的細(xì)胞使用CVB3和80 μg/mL川牛膝多糖處理。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理分析，計量資料以（x±s）表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川牛膝多糖對心肌細(xì)胞凋亡和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，CVB3組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）;與CVB3組比較，CVB3+川牛膝多糖20、40、80、160 μg/mL組的細(xì)胞凋亡率均下降（P<0.05）。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，CVB3組心肌細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.05）;與CVB3組比較，CVB3+川牛膝多糖20、40、80、160 μg/mL組的cleaved caspase-3蛋白水平均下降（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2 川牛膝多糖對心肌細(xì)胞氧化損傷的影響 與空白組相比，CVB3組心肌細(xì)胞中MDA含量明顯增加，SOD、CAT活性均顯著降低（P<0.05）;與CVB3組比較，CVB3+川牛膝多糖80 μg/mL組MDA含量明顯減少，SOD、CAT活性均顯著提高（P<0.05）。見表2。

2.3 川牛膝多糖對心肌細(xì)胞中Sema7A基因表達(dá)的影響 qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，CVB3組心肌細(xì)胞中Sema7A mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯高于空白組（P<0.05），CVB3+川牛膝多糖80 μg/mL組心肌細(xì)胞中Sema7A mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著低于CVB3組（P<0.05）。見表3、圖2。

2.4 抑制Sema7A表達(dá)對CVB3感染心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響 與空白組比較，CVB3明顯影響Sema7A mRNA、Sema7A蛋白、MDA含量、SOD活性、CAT活性、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率（P<0.05）。在心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-Sema7A，發(fā)現(xiàn)CVB3+si-Sema7A組心肌細(xì)胞中Sema7A mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯低于CVB3+si-con組（P<0.05）。與CVB3+si-con組相比，CVB3+si-Sema7A組心肌細(xì)胞中MDA含量明顯減少，SOD活性、CAT活性均顯著提高，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表4。

2.5 過表達(dá)Sema7A逆轉(zhuǎn)了川牛膝多糖對CVB3感染心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響 CVB3組與CVB3+川牛膝多糖80 μg/mL組心肌細(xì)胞中Sema7A mRNA、Sema7A蛋白、MDA含量、SOD活性、CAT活性、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。CVB3+川牛膝多糖80 μg/mL+pcDNA Sema7A組較CVB3+川牛膝多糖80 μg/mL+pcDNA組明顯提高心肌細(xì)胞內(nèi)Sema7A mRNA、Sema7A 蛋白表達(dá)量，增加MDA含量，降低SOD活性、CAT活性，提升cleaved caspase-3蛋白水平，并提高細(xì)胞凋亡率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表5、圖4。

3 討論

病毒性心肌炎是一種常見的心血管疾病，嚴(yán)重危害人們的健康，甚至導(dǎo)致猝死[11-12]。病毒性心肌炎與年齡小于40歲的成年人或兒童的心源性猝死有關(guān)[13]。病毒性心肌炎的死亡率主要歸因于其易于發(fā)展為慢性炎癥性和擴(kuò)張型心肌病，其特點為預(yù)后不良[14]。目前，盡管對該疾病病理生理學(xué)機(jī)制的診斷和了解取得了顯著進(jìn)展，但仍然沒有特定的治療方法。流行病學(xué)研究表明，CVB3是病毒性心肌炎最常見的病原體[15]。CVB3可以通過心肌細(xì)胞的凋亡和壞死誘導(dǎo)心肌損傷，由病毒基因組翻譯產(chǎn)生的蛋白可以以各種方式顯著影響細(xì)胞蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，包括關(guān)閉宿主蛋白，切割轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞凋亡等[16]。因此，有效控制CVB3感染是改善心肌損傷的關(guān)鍵。

川牛膝多糖是川牛膝活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等活性[17]。既往研究表明，磷酸化的川牛膝多糖可以促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和自然殺傷細(xì)胞（NK）的殺傷活性，刺激小鼠免疫應(yīng)答[18]。川牛膝多糖可以抑制犬細(xì)小病毒感染F81細(xì)胞的能力，表現(xiàn)出一定的抗病毒作用。4個磷酸化川牛膝多糖（pRCPS1-4）表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性[19]。本研究中，CVB3誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，并造成氧化損傷，而川牛膝多糖可以有效減輕CVB3對心肌細(xì)胞的作用，在一定程度上阻滯病毒性心肌炎進(jìn)展。川牛膝多糖明顯抑制CVB3感染的心肌細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、MDA水平，并提高抗氧化酶SOD、CAT活性，顯示出對病毒性心肌炎的保護(hù)作用。

Sema7A與心血管疾病密切相關(guān)。Sema7A是在病毒性心肌炎中表達(dá)上調(diào)，敲除Sema7A可顯著改善心臟功能，提高CVB3感染小鼠7 d時的存活率，減少炎癥反應(yīng)，Sema7A可能在CVB3誘導(dǎo)的心肌炎過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。本項研究顯示，抑制Sema7A表達(dá)明顯降低CVB3感染心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、MDA含量（P<0.05），顯著提高SOD活性、CAT活性（P<0.05），表明Sema7A是CVB3感染心肌細(xì)胞過程中重要的影響因子。而川牛膝多糖明顯下調(diào)CVB3感染心肌細(xì)胞中Sema7A mRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05），提示川牛膝多糖的保護(hù)作用與Sema7A密切相關(guān)。為了進(jìn)一步揭示川牛膝多糖對病毒性心肌炎的作用機(jī)制，構(gòu)建過表達(dá)Sema7A的心肌細(xì)胞，并使用CVB3和川牛膝多糖進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Sema7A逆轉(zhuǎn)了川牛膝多糖對CVB3感染心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的抑制作用，表明調(diào)控Sema7A表達(dá)可能是川牛膝多糖保護(hù)病毒性心肌炎的重要機(jī)制之一。

綜上所述，川牛膝多糖明顯降低CVB3感染的心肌細(xì)胞凋亡、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、MDA含量，提高SOD、CAT活性，有效減輕病毒性心肌炎細(xì)胞凋亡和氧化損傷，其保護(hù)作用可能是通過調(diào)控Sema7A表達(dá)實現(xiàn)的，這為病毒性心肌炎的治療提供了新的思路。

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（收稿日期：2021-06-07） （本文編輯：占匯娟）