吳發(fā)勝 李建福 陳 慧 謝家童 張 暉 周堯紅

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院放療科，廣西南寧市 530011；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧市 530001)

【提要】 在我國(guó)，食管癌已經(jīng)成為一種高發(fā)病率、高致死率的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展受到多種因素的影響。外泌體是一種納米級(jí)的微囊，含有多種成分，是細(xì)胞之間和組織之間信號(hào)傳遞的重要介質(zhì)。本研究總結(jié)近年來有關(guān)外泌體診治食管癌的研究進(jìn)展，探討外泌體對(duì)食管癌的調(diào)控機(jī)制及其臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)外泌體用于食管癌的診斷及治療作用提出展望，以期為食管癌的診療提供新的策略。

食管癌是影響人類健康的主要惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年中國(guó)新增食管癌患者307 359例，新增死亡患者283 433例，食管癌的患病率、病死率在全球癌癥中分別位居第七位和第六位[1]，食管癌患者的5年總生存率為20%～30%[2]。食管癌的臨床癥狀包括吞咽異物感、吞咽困難、胸骨后疼痛等，在組織學(xué)上可分為鱗癌和腺癌，我國(guó)食管癌患者主要以鱗狀細(xì)胞癌為主，而歐美國(guó)家患者以腺癌為主[3]。由于食管癌起病隱匿，早期多無(wú)明顯癥狀，所以大多數(shù)食管癌患者在就診時(shí)其病情常已處于晚期，這使得該病的治療面臨極大的挑戰(zhàn)[4]。目前，食管癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、藥物治療和聯(lián)合治療等，其中藥物治療主要包括新輔助化療、輔助化療、中醫(yī)藥治療，以及近年來出現(xiàn)的分子靶向治療和免疫治療等[5]。外泌體是包含蛋白質(zhì)、脂類、核酸等多種成分的小膜泡，目前被認(rèn)為是一種特殊的分泌膜泡。有研究顯示，外泌體在腫瘤的生長(zhǎng)過程中扮演了重要角色，其參與了食管癌細(xì)胞的存活、增殖、遷移、侵襲及微環(huán)境的構(gòu)成，并在食管癌的診斷和治療中具有重要價(jià)值[6]。本文就外泌體在食管癌的發(fā)生及發(fā)展、診斷及治療中的作用展開綜述，以期突破目前食管癌的治療瓶頸。

1 外泌體概述

20世紀(jì)70年代Rose Johnstone首次提出外泌體是網(wǎng)織紅細(xì)胞在成熟過程中分泌的小泡，并將其視為參與分子廢物排泄的囊泡[7]。隨后，研究發(fā)現(xiàn)外泌體廣泛存在于生物的體液中，且在體內(nèi)具有多種生理功能并參與多種病理過程[8]。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，大小在30～150 nm之間[9]，密度在1.13～1.19 g/mL之間[10]，其囊泡內(nèi)包含核酸、脂質(zhì)、多肽等，是細(xì)胞之間聯(lián)系的紐帶[11]。外泌體有固定的信號(hào)通路，其在產(chǎn)生、分泌、運(yùn)輸、吸收、釋放過程中參與了人體的生理和病理過程[12-13]。研究表明外泌體在癌癥的發(fā)生、發(fā)展及藥物治療中具有重要的作用，對(duì)外泌體進(jìn)行深入的研究可為腫瘤的診斷及治療提供新思路[14]。

2 外泌體參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展過程

2.1 促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖 有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與食管癌多個(gè)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，在癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中有著重要作用[15]。miRNA是一種包含19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，腫瘤細(xì)胞可以釋放出多種含有miRNA的外泌體，刺激腫瘤細(xì)胞在微環(huán)境中轉(zhuǎn)移，源于外泌體的miRNA在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[15]。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)外泌體來源的miR-95-5p通過其功能靶基因磷酸酶-張力蛋白同源性基因影響其下游蛋白的表達(dá)，從而在腫瘤的微環(huán)境中促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。還有研究顯示，食管癌組織中miR-28-5p的表達(dá)水平高于癌旁組織，且miR-28-5p可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是miR-28-5p通過降低轉(zhuǎn)移抑制因子-1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)食管癌的發(fā)展[17]。外泌體來源的長(zhǎng)鏈非編碼RNA在食管癌的生物學(xué)過程中也是一種很重要的基因調(diào)控因子，相關(guān)研究表明LINC00885在食管癌組織中高表達(dá)，其可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖[18]。Shi等[19]的研究證實(shí)LINC00337也可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖，并在食管癌中充當(dāng)腫瘤啟動(dòng)子。

2.2 介導(dǎo)食管癌細(xì)胞的遷移與侵襲 外泌體可通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞中，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲。腫瘤細(xì)胞外泌體含多種基質(zhì)金屬蛋白酶，其可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)及剪切細(xì)胞黏附分子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。Khazaei等[21]的研究顯示，外泌體來源的miR-451是癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的信號(hào)分子，為癌細(xì)胞的遷移及腫瘤的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了條件。由此可見，外泌體在食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲中起關(guān)鍵的作用，是食管癌發(fā)展的重要因素。

2.3 參與食管癌微環(huán)境的構(gòu)成 腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在腫瘤微環(huán)境中除了腫瘤細(xì)胞，還有淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、腫瘤血管及成纖維細(xì)胞等，這些非惡性細(xì)胞在受到刺激及失控狀態(tài)下大量增殖，參與癌變的各個(gè)階段[22]。癌細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間的聯(lián)系是雙向的，微環(huán)境中細(xì)胞之間的聯(lián)系主要通過黏附分子、電偶聯(lián)和縫隙連接進(jìn)行，但細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和外泌體的經(jīng)典旁分泌信號(hào)也參與細(xì)胞之間的生物學(xué)過程[23]。血管生成是惡性腫瘤進(jìn)展的重要因素，相關(guān)研究表明，腫瘤外泌體可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和趨化因子受體信號(hào)途徑，增強(qiáng)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)能力[24]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以與各種免疫細(xì)胞之間的相互作用，抑制自然殺傷細(xì)胞和效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化，并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞增殖，使免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成[25]。阻斷外泌體介導(dǎo)的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成可能是腫瘤治療的新方向。

3 外泌體在食管癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值

食管癌早期沒有特異性表現(xiàn)，患者常因診斷延誤而錯(cuò)過最佳治療期，早期診斷成為治療食管癌的關(guān)鍵。為此，越來越多的研究者試圖尋找可以診斷腫瘤的標(biāo)志物。在生理環(huán)境下廣泛存在，且能使其荷載物穩(wěn)定保存的外泌體成為了研究指標(biāo)之一[26]。外泌體中的miRNA具有多樣性和特異性，例如食管鱗狀細(xì)胞癌患者血清外泌體中的miRNA-21表達(dá)量增加，而前列腺癌患者血清外泌體miRNA-141呈高表達(dá)[27]。同時(shí)，外泌體的蛋白可能反映其細(xì)胞起源，也有助于腫瘤的診斷。例如，黑色素瘤患者與健康對(duì)照相比，其外周循環(huán)外泌體中的MET和MET磷酸化表達(dá)增加[27]。

有研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清外泌體中的miR-1246表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，在手術(shù)切除腫瘤后，其表達(dá)水平降低；受試者工作特征曲線分析顯示，血清外泌體中的miR-1246診斷食管癌患者的敏感性和特異性分別為71.3%和73.9%；血清外泌體中的miR-1246與食管癌患者腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移期顯著相關(guān)[28]。有學(xué)者在人食管癌細(xì)胞和裸鼠食管癌細(xì)胞移植瘤中檢測(cè)到唾液外泌體高爾基體膜蛋白1-N-α-乙酰轉(zhuǎn)移酶35嵌合體RNA(Golgi membrane protein 1-N-alpha acetyltransferases 35 chimeric RNA,G-NchiRNA)的表達(dá)，唾液外泌體G-NchiRNA水平可以反映腫瘤負(fù)荷[29]。這提示唾液外泌體G-NchiRNA或可作為診斷食管癌的一種生物標(biāo)志物。

4 外泌體在食管癌治療中的作用

4.1 免疫治療 隨著研究的不斷深入，免疫療法在腫瘤治療中廣泛應(yīng)用，為癌癥患者帶來了新的希望。外泌體可通過增強(qiáng)抗原遞呈或直接激活免疫細(xì)胞加強(qiáng)免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。孔祥偉等[30]采用Western blot檢測(cè)人間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)外泌體中CD63、CD81呈陽(yáng)性表達(dá)，初步證明人間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體有免疫調(diào)節(jié)功能。Romagnoli等[31]發(fā)現(xiàn)，將T淋巴細(xì)胞與經(jīng)樹突狀細(xì)胞外泌體處理的腫瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)，T淋巴細(xì)胞顯示出更高的γ干擾素分泌率，這表明在腫瘤細(xì)胞中加入外泌體可增強(qiáng)其激活T淋巴細(xì)胞的能力。Li等[32]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的脆性X信使核糖核蛋白1-反義RNA1(fragile X messenger ribonucleoprotein 1-antisense RNA1,FMR1-AS1)在食管癌患者中存在特異性表達(dá)，且腫瘤微環(huán)境中也可以檢測(cè)到外泌體FMR1-AS1，血清外泌體中的FMR1-AS1水平與患者的生存期存在一定的關(guān)聯(lián)，外泌體中的FMR1-AS1可通過激活Toll樣受體7-核因子κB信號(hào)通路，上調(diào)受體細(xì)胞中的c-Myc癌基因水平，激活機(jī)體免疫。因此，外泌體中的FMR1-AS1有希望成為治療食管癌患者的靶點(diǎn)之一。

4.2 藥物載體 外泌體是一種可以介導(dǎo)細(xì)胞間信息交換和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)慕橘|(zhì)，其可作為藥物的載體。如Wang等[33]將M1極化巨噬細(xì)胞來源的外泌體(M1-polarized macrophage-derived exosome,M1-Exos)作為紫杉醇(paceitaxel,PTX)的藥物載體，采用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)PTX-M1-Exos對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的殺傷作用，并采用荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示M1-Exos可作為載體將PTX導(dǎo)入腫瘤組織中，增強(qiáng)化療藥物對(duì)荷瘤小鼠的抗腫瘤作用。此外，血清中的外泌體也可作為藥物的載體。Yu等[34]在多種外泌體中加載熒光染料后將其通過皮下注射至小鼠體內(nèi)，檢查外泌體在淋巴結(jié)中的積累情況，發(fā)現(xiàn)胎牛血清來源的外泌體可以作為免疫刺激劑的載體進(jìn)入淋巴結(jié)，其被運(yùn)輸?shù)搅馨徒Y(jié)的表面區(qū)(包膜下竇的巨噬細(xì)胞區(qū))和淋巴結(jié)的內(nèi)側(cè)副皮質(zhì)區(qū)(T淋巴細(xì)胞區(qū))，從而將免疫刺激分子有效地輸送到抗原提呈細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，在免疫刺激生物分子的激活下細(xì)胞因子γ干擾素和腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)CD3+T淋巴細(xì)胞的作用增強(qiáng)。

4.3 腫瘤疫苗 腫瘤組織的外泌體大多都有其特定的腫瘤抗原，因此，外泌體用于疫苗的研發(fā)也成為研究的熱點(diǎn)。1998年，Zitvogel等[35]首次使用樹突狀細(xì)胞來源的外泌體作為腫瘤疫苗，并用于動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)該疫苗可以激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞以發(fā)揮抗腫瘤作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，從冷凍臍帶血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞中分離得到的外泌體可誘導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)，與基于細(xì)胞的免疫療法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，對(duì)癌細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷活性[36]。而冷凍臍血單核細(xì)胞容易獲得，故其外泌體有望成為制備腫瘤疫苗的原材料。有研究發(fā)現(xiàn)，給予食管癌模型小鼠一種食管癌選擇性樹突狀細(xì)胞外泌體疫苗，可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間[37]。該疫苗通過刺激食管癌模型小鼠的免疫系統(tǒng)重塑了腫瘤免疫微環(huán)境，并通過CD8+T淋巴細(xì)胞依賴機(jī)制發(fā)揮免疫治療作用[37]。由此可見外泌體疫苗為食管癌提供了新的治療方案。

4.4 與中醫(yī)藥的聯(lián)合應(yīng)用 近年來，中醫(yī)藥抗腫瘤的臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究有較大的進(jìn)展，中醫(yī)藥聯(lián)合手術(shù)、放化療、靶向治療等在食管癌的治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。無(wú)論是單味中藥或是復(fù)方中藥，都可以多靶點(diǎn)、多途徑地參與腫瘤的治療，而中藥可以通過調(diào)控外泌體來發(fā)揮其靶向調(diào)控、遠(yuǎn)距離傳輸?shù)闹委熥饔肹38]。陳玉龍[39]研究發(fā)現(xiàn)，將食管癌 EC9706 細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)后，EC9706 細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性有所增加，其機(jī)制與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體中miR-21的表達(dá)上調(diào)有關(guān)；啟膈散是中醫(yī)行氣化痰的代表方，啟膈散含藥血清可以增加食管癌細(xì)胞EC9706對(duì)順鉑的敏感性，從而增強(qiáng)順鉑致細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，其機(jī)制與啟膈散含藥血清降低臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體中miR-21的表達(dá)，上調(diào)miR-21靶分子程序性細(xì)胞死亡蛋白4、磷酸酶-張力蛋白同源性基因表達(dá)有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，中藥植物外泌體含有的miRNA可以利用外泌體作為載體來調(diào)控其他物種的基因表達(dá)，以達(dá)到抗腫瘤的目的[40]。治療腫瘤的中藥存在有效成分溶解度低、生物利用度低等問題，而外泌體作為新型藥物載體，可以更好地將中藥有效成分遞送至靶細(xì)胞。有學(xué)者認(rèn)為利用自源性外泌體作為中藥的載體具有良好的生物相容性與非免疫原性，可以提高藥物的有效利用率，降低藥物成分的清除率[41]，從而使中藥發(fā)揮更好的抗腫瘤作用。

5 展 望

外泌體參與了食管癌的發(fā)生和發(fā)展，研究其作用機(jī)理可為外泌體診治食管癌提供理論依據(jù)，但有關(guān)外泌體的研究正處于起步階段，其在腫瘤中的作用機(jī)制尚不清楚，且人工合成外泌體的技術(shù)尚未成熟，如何精準(zhǔn)制訂外泌體治療腫瘤的方案還有待深入研究。