陳 曦 尹良宏 鄭天威 殷 悅 張 萌 宮世玲 周 倩 羅立平 劉 騰 周 毅 田 軍 韓 雪

(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，北京 100012)

棒狀桿菌(Corynebacteriumspp.)相關(guān)的過度角化癥(Corynebacterium-associated hyperkeratosis)是由牛棒狀桿菌(Corynebacteriumbovis)引起的裸鼠急性、高度接觸性傳染病，以過度角化性皮炎、棘皮癥為特征，典型的臨床癥狀為全身出現(xiàn)鱗皮樣白色皮屑，黏附皮膚表面，俗稱“鱗皮病(scaly skin disease)”[1]。裸鼠感染牛棒狀桿菌后，除了引起一過性過度角化性皮炎和棘皮癥之外，對化學(xué)治療藥物毒性敏感性提高、體質(zhì)量減輕及降低移植腫瘤的生長速度，因此不適于再進(jìn)行腫瘤學(xué)、免疫學(xué)及毒理學(xué)研究。歐洲實驗動物科學(xué)聯(lián)合會(FELESA)將牛棒狀桿菌列為其他必要性病原，但2010年我國首次報道該病，目前還沒有將此病原列為嚙齒類實驗動物必檢項目。近年來，隨著實驗動物資源及生物樣本資源共享增加，該病原在國內(nèi)實驗動物設(shè)施多次檢出。由于牛棒狀桿菌的高度傳染性、可經(jīng)氣溶膠傳播、在環(huán)境中很難清除等特性，一旦發(fā)生牛棒狀桿菌感染，對動物設(shè)施管理及后續(xù)的裸鼠飼養(yǎng)和科學(xué)研究帶來較大的風(fēng)險[2]。

1 病原學(xué)

牛棒狀桿菌屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，革蘭氏染色陽性小桿菌，呈棒錘狀或微彎曲、排列不規(guī)則、可散在或成對或呈V形或柵欄狀排列、無莢膜、無鞭毛、不產(chǎn)生芽胞且為條件性致病菌。

2 流行病學(xué)

牛棒狀桿菌的主要傳染源為感染該菌的小鼠和其他動物體外接種用的細(xì)胞。Clifford等[3]和Field等[4]均報道，該菌在動物間通過直接接觸傳播，如：空氣傳播、人員接觸或通過污染物如飼養(yǎng)員手套、實驗器具、墊料、飼料等。牛棒狀桿菌也可通過異種移植物傳播，如移植腫瘤系。免疫正常的大鼠和小鼠感染后發(fā)病率和死亡率均低，致死率一般不足1%，但裸鼠發(fā)病率超過50%，病死率與設(shè)施類型、日常操作流程及感染途徑密切相關(guān)。

感染牛棒狀桿菌的小鼠，無明顯的品種、品系、性別和年齡差異(表1)，但是不同品系感染該菌后的發(fā)病情況和病原攜帶時間有較大差異。免疫正常大鼠和小鼠通常為無癥狀攜帶者，短暫攜帶病原，但裸鼠非常易感，感染后潛伏期通常為7～10 d。Holly等[8]證實，從未接觸過病原體的裸鼠感染后可迅速產(chǎn)生“鱗屑”典型癥狀，黏附皮膚表面，并長期攜帶病原；免疫缺陷有毛小鼠偶爾出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，短暫攜帶病原。

表1 牛棒狀桿菌易感品系

3 臨床癥狀

感染牛棒狀桿菌的裸鼠伴隨體質(zhì)量減輕、攝水量增加、異種移植物生長緩慢、對化學(xué)療法的敏感性增加、成年裸鼠死亡率升高等現(xiàn)象。如果動物感染后存活，角化增生會消失，但棘皮病持續(xù)，真皮層炎癥細(xì)胞會稍微減少。牛棒狀桿菌可迅速引起從未接觸過病原體的動物產(chǎn)生“鱗屑”癥狀，即感染動物全身出現(xiàn)鱗片樣白色皮屑，黏附皮膚表面，俗稱“鱗皮病”。病變通常出現(xiàn)在暴露感染(如暴露于已感染動物或設(shè)施)7～10 d后，是新生動物牛棒狀桿菌感染典型特征?！镑[屑”臨床癥狀在14～20 d消除后，動物仍處于感染狀態(tài)并散播病原體。Holly等[9]報道，曾被感染過的動物群體可呈持續(xù)感染狀況，但癥狀與從未接觸病原體的動物比較輕很多，例如：SCID等有毛的免疫缺陷鼠出現(xiàn)脫毛、形成禿塊等癥狀。

4 病理變化

組織病理學(xué)觀察可見被牛棒狀桿菌感染的動物皮膚表皮增生、過度角質(zhì)化、棘皮層增厚及輕度皮炎。白玉等[10]介紹，在受感染動物的皮膚表面角質(zhì)和毛囊內(nèi)可見革蘭氏陽性菌、巨噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞浸潤，革蘭氏染色可在超角化層中觀察到牛棒狀桿菌。

5 實驗室檢測和診斷

5.1 細(xì)菌分離和鑒定

按照邢進(jìn)等[11]方法，無菌操作采取疑似感染牛棒狀桿菌動物的皮膚拭子、皮屑及呼吸道分泌物，接種于含有5%羊血的哥倫比亞CNA培養(yǎng)基，(36±1)℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，觀察是否有可疑菌落，如菌落形態(tài)為1～2 mm，光滑、點狀、白色且不溶于血，經(jīng)革蘭氏染色為陽性短桿菌，V型排列，則可繼續(xù)進(jìn)行菌落純化和生化鑒定。

5.2 PCR檢測

目前，實驗室多采用qPCR方法檢測受感染動物的皮膚拭子、糞便、口咽樣品或污染環(huán)境物拭子，也可檢測腫瘤系及環(huán)境棉拭子。qPCR是通過兩條標(biāo)記的熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的引物對牛棒狀桿菌16s rDNA進(jìn)行擴(kuò)增[12]。

5.3 鑒別診斷

牛棒狀桿菌感染需要和彌散性皮炎進(jìn)行鑒別診斷。從發(fā)病率來說，彌散性皮炎通常為散發(fā)，而牛棒狀桿菌感染發(fā)病率可達(dá)到50%以上。從病理學(xué)上來看，皮膚棘層增厚為牛棒狀桿菌感染小鼠的特有表現(xiàn)之一，也可結(jié)合實驗室診斷，如細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定和分子生物學(xué)方法進(jìn)行確診。

6 被感染設(shè)施的消毒和凈化

6.1 首次發(fā)生牛棒狀桿菌感染

動物設(shè)施首次發(fā)生牛棒狀桿菌感染時，首要目標(biāo)是篩查感染范圍、加強(qiáng)消毒、控制感染范圍，并盡快清除病原。當(dāng)發(fā)現(xiàn)某個籠盒內(nèi)有動物出現(xiàn)皮屑癥狀時，及時取樣送檢，同時立即停止該籠盒的任何操作，將該籠盒密封，飼料墊料高壓滅菌后進(jìn)行無害化處理，動物做淘汰處理。整個房間作為疑似感染房間，進(jìn)行房間多點篩查(超凈臺、房間環(huán)境、排風(fēng)口)，控制人員和物料進(jìn)出，加強(qiáng)消毒措施。一旦檢測確診為牛棒狀桿菌感染，建議無害化處理該飼養(yǎng)房間內(nèi)所有動物，并過氧化氫(H2O2)熏蒸凈化。

6.2 持續(xù)發(fā)生牛棒狀桿菌感染

若使用已發(fā)生過牛棒狀桿菌感染的IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)，且短時間內(nèi)動物房無法做到徹底凈化，則首要任務(wù)是降低環(huán)境中的牛棒狀桿菌菌群量，以保護(hù)易感動物及降低動物感染率。當(dāng)某個籠盒中，有裸鼠出現(xiàn)皮屑癥狀，應(yīng)盡快將該籠盒內(nèi)動物實施安樂死，并對動物尸體和籠內(nèi)飼料、墊料和飲水進(jìn)行無害化處理，在安樂死和轉(zhuǎn)移污染物時要注意避免二次污染。如果感染牛棒狀桿菌的動物模型十分珍貴無法替代或已接近實驗?zāi)┢?，研究結(jié)果十分重要，考慮到IVC系統(tǒng)的相對隔離作用，可以將受感染動物繼續(xù)飼養(yǎng)一段時間以盡可能減小研究損失。此時，所有換籠操作必須在生物安全柜中進(jìn)行，且注意最后操作有癥狀動物的籠盒，并對該籠盒(包含盒內(nèi)物料)進(jìn)行高壓滅菌處理。為盡可能地降低傳播風(fēng)險，減少籠盒飼養(yǎng)的動物數(shù)，更換籠盒的頻率可降低為兩周一次。操作后要對所用儀器、設(shè)備、物料、房間、工作服等進(jìn)行嚴(yán)格消毒處理。實驗結(jié)束后，立即對整個飼養(yǎng)房間和操作間進(jìn)行徹底凈化。

6.3 消除牛棒狀桿菌的成功經(jīng)驗

Emily等[13]和Ragland等[14]報道顯示，使用H2O2消毒劑配合H2O2發(fā)生器和加速器進(jìn)行設(shè)施消毒凈化，可成功凈化牛棒狀桿菌感染的設(shè)施。將飼養(yǎng)間內(nèi)的IVC斷開連接，其上所有籠盒轉(zhuǎn)移到已消毒干凈的IVC籠架并放置在中轉(zhuǎn)間過夜等待消毒完畢。卸下籠盒被污染的IVC籠架轉(zhuǎn)至清洗間清洗[13]。對飼養(yǎng)間內(nèi)的超凈臺表面進(jìn)行消毒，并更換過濾裝置；飼養(yǎng)間內(nèi)架子、抽屜等打開，對其他儀器表面進(jìn)行消毒，封閉飼養(yǎng)間的進(jìn)、出風(fēng)口，將H2O2發(fā)生器和加速器轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)間，當(dāng)天進(jìn)行H2O2熏蒸。消毒結(jié)束后，檢測H2O2濃度，低于1 mg/L才能允許人員再次進(jìn)入，同時將中轉(zhuǎn)間的IVC籠盒和籠架轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)間[13]。

房間凈化后，需要檢測牛棒狀桿菌，建議采用PCR方法鑒定牛棒狀桿菌[13]。采樣對象包括房間和走廊表面、IVC籠架排風(fēng)總管、IVC通風(fēng)單元出風(fēng)口過濾網(wǎng)、連接軟管、固定和可移動設(shè)備表面及小鼠糞便。Emily等[13]報道，采樣頻率以月為單位，房間H2O2熏蒸以半年為單位整個設(shè)施循環(huán)進(jìn)行。

7 人源腫瘤組織移植過程中消除牛棒狀桿菌感染

如果荷瘤鼠感染牛棒狀桿菌，出于實驗需要繼續(xù)使用這些腫瘤組織，因此無菌操作，防止牛棒狀桿菌污染的腫瘤組織將病原傳播給陰性的裸鼠至關(guān)重要，建議可采用Christopher等[15]報道的流程進(jìn)行操作。

7.1 腫瘤摘取

根據(jù)Christopher等[15]方法，供體小鼠(經(jīng)檢測為牛棒狀桿菌陽性)經(jīng)CO2安樂死，立即轉(zhuǎn)移至指定生物安全柜內(nèi)，完全浸泡在2%葡萄糖酸氯己定(CHG)溶液中至少5 min。從CHG浸泡液中取出供體小鼠，使用無菌紗布去除多余浸泡液。專門一套器械操作小鼠皮膚，垂直于背部中線剪開背部皮膚，用手?jǐn)U張皮膚切口以充分暴露腫瘤組織，使用另一套器械摘取腫瘤組織，快速放入轉(zhuǎn)移液中。遇到腫瘤組織與皮膚深層黏連或腫瘤已經(jīng)潰爛，摘取腫瘤時不要留下可能與皮膚接觸的部分，只摘取安全部分以確保取材的腫瘤組織無牛棒狀桿菌感染。

7.2 腫瘤轉(zhuǎn)移

根據(jù)Christopher等[15]方法，腫瘤組織摘取后，快速放入有轉(zhuǎn)移液的離心管內(nèi)，立刻旋緊蓋子，用消毒液噴霧外表面，再用浸泡過消毒液的一次性無菌布擦拭消毒。隨后，離心管逐個用浸泡過消毒液的一次性無菌布包裹，作用5 min后帶出房間，轉(zhuǎn)到指定的潔凈操作區(qū)域。腫瘤組織轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，剪成3 mm3的碎塊，用于移植。用異氟烷麻醉確認(rèn)無牛棒狀桿菌感染的受體小鼠，并用75%乙醇擦拭消毒接種部位皮膚。使用套管針將腫瘤塊注射到受體小鼠背部兩側(cè)靠近臀部位置。如果需要切開皮膚進(jìn)行手術(shù)原位移植，可剪開5 mm大小切口，手術(shù)鉗撐開皮膚，將腫瘤塊埋入皮下特定位置，再用縫合夾縫合傷口。

8 牛棒狀桿菌感染的預(yù)防措施

鑒于牛棒狀桿菌對動物及科學(xué)研究帶來的危害，國外將牛棒狀桿菌作為嚙齒類實驗動物設(shè)施重點監(jiān)測的病原之一。該菌對于免疫缺陷動物的危害最大，建議將牛棒狀桿菌加入到免疫缺陷動物的季度監(jiān)測范圍，同時加強(qiáng)對設(shè)施的管理。

8.1 外來動物控制

直接訂購動物時，應(yīng)要求提供牛棒狀桿菌的檢測報告；若動物是從其他單位轉(zhuǎn)移來的，需對動物進(jìn)行牛棒狀桿菌檢測合格后方可準(zhǔn)入。動物到達(dá)設(shè)施后，用消毒劑進(jìn)行外包裝消毒后，經(jīng)傳遞窗傳入，并在超凈臺或生物安全柜內(nèi)打開運輸箱，將動物轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)盒中。

8.2 飼養(yǎng)管理

建議不要將免疫缺陷動物與免疫正常動物在同一房間內(nèi)飼養(yǎng)，墊料更換、添加飼料和飲水需在超凈臺或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，使用前后均需進(jìn)行消毒。從動物轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)盒開始，每天觀察并記錄動物的健康狀況。由于牛棒狀桿菌感染的臨床癥狀很容易發(fā)現(xiàn)，日常觀察對于及時發(fā)現(xiàn)“鱗屑”癥狀具有重要意義。

8.3 移植物使用前檢測

移植物接種前必須進(jìn)行牛棒狀桿菌檢測，結(jié)果為陰性方可使用。采用Russo等[16]方法，取100 μL腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液或1～3 mm3的腫瘤組織，提取DNA，使用qPCR方法進(jìn)行牛棒狀桿菌檢測。

8.4 日常監(jiān)測

對于飼養(yǎng)裸鼠的房間，每季度或者每月采集環(huán)境樣品(房間排風(fēng)口、IVC籠架排風(fēng)口、超凈臺拭子樣品)進(jìn)行牛棒狀桿菌檢測，以便及時發(fā)現(xiàn)可能的感染[17]。對于出現(xiàn)“鱗屑”癥狀的動物，可以采集皮膚拭子進(jìn)行牛棒狀桿菌檢測。

8.5 業(yè)務(wù)培訓(xùn)

加強(qiáng)裸鼠及其他免疫缺陷動物飼養(yǎng)員和實驗人員的培訓(xùn)，提高對牛棒狀桿菌感染的防控意識和診斷能力，尤其是提高棒狀桿菌相關(guān)的過度角化癥和彌散性皮炎的鑒別診斷水平，及時發(fā)現(xiàn)、報告和處置疑似感染，消除隱患。