黃利全 陳桂園 胡慶華 胡 波 方露燕

(1. 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，金華 321017)(2. 金華市中醫(yī)院，金華 321017)(3. 金華市人民醫(yī)院，金華 3210002)

抗腫瘤藥物的化學(xué)治療簡稱化療，是腫瘤患者的三大治療手段之一。通過外周靜脈注射化療藥物時(shí)，常致靜脈炎的發(fā)生，甚至出現(xiàn)局部皮膚潰瘍、皮下組織壞死及功能障礙等嚴(yán)重并發(fā)癥。張鹍等[1]研究認(rèn)為，經(jīng)外周置入中心靜脈導(dǎo)管(peripherally inserted central catheter，PICC)指由外周靜脈穿刺插管，并使其頭端位于上腔靜脈中下段的中心靜脈導(dǎo)管置入術(shù)，上腔靜脈處較大的血流量可迅速稀釋藥物，降低化療藥物對血管壁的刺激，減少化療藥物造成的局部組織紅腫、疼痛或壞死。然而，PICC置管患者容易發(fā)生靜脈血栓、靜脈炎、感染等不良反應(yīng)，影響治療效果，甚至對患者的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2-3]。由于腫瘤患者存在個體差異、不同的病因、不統(tǒng)一的防護(hù)方案、無法截取留置血管進(jìn)行光鏡觀察等原因，限制了對化療性靜脈損傷的研究。因此，本研究選擇酒石酸長春瑞濱注射液(以下簡稱長春瑞濱)建立PICC靜脈化療動物模型，對化療性靜脈損傷的發(fā)生機(jī)制和病理反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以期為腫瘤患者探尋針對PICC相關(guān)性靜脈損傷的防護(hù)措施。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

普通級新西蘭大白兔(以下稱實(shí)驗(yàn)兔)48只，體質(zhì)量1.2～2.5 kg，雌雄各半，雌兔未孕，購自金華市實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2017-0004，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(浙)2016-0008，在金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物倫理審批，IACUC編號：2019017。實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)編號，單籠飼養(yǎng)，按編號排列兔籠。

1.2 主要試劑與儀器

1.9 Fr×50 cm的單腔PICC導(dǎo)管(批號：1901002，優(yōu)力捷公司)；0.9%氯化鈉溶液(批次：A18122701-1，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；酒石酸長春瑞濱注射液(批次：181001，江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。全自動凝血分析儀RAC-030(R01001，20181225,深圳雷杜生命科技)，獸用全自動血液細(xì)胞分析儀(型號：BC-2800vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)； ELISA試劑盒(SEA029Ra，批次L210311678；SEA569Ra，批次L210322259；SEA079Rb，批次L210224762；SEA073Rb，批次L210323353；SEA821Rb，批次L210223758；CEA506Rb，批次L210323381，武漢云克隆科技股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組方法：對48只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行編號。隨機(jī)數(shù)字表法，分為第1、2、3、7、14、21、23和24天，n=6，共完成一療程(2個周期)的化療。第一周期為第1～3天，第2天用藥，第二周期為第22～24天，第23天用藥。

1.3.2建模方法：規(guī)格為10 mg/mL的酒石酸溶解于10 mL生理鹽水，按Meeh-Rubner氏公式計(jì)算家兔體表面積，確定25 mg/m2作為實(shí)驗(yàn)劑量，使用輸液泵緩慢注射15 min，于置管后第2天和第23天各給藥一次。用藥畢，使用肝素鹽水按脈沖式正壓法封管。在化療藥物間歇期，按正規(guī)操作完成PICC置管維護(hù)，每周更換一次敷料，遇敷貼潮濕或卷邊隨時(shí)給予消毒和更換。

1.3.3模型評價(jià)方法：評判成功建立PICC動物模型的方法為一次穿刺成功，局部無損傷、滲血，X光透視下確定導(dǎo)管末端無扭曲、折疊，留置在實(shí)驗(yàn)兔前腔靜脈。實(shí)驗(yàn)兔給藥后存活，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。

1.3.4標(biāo)本提取方法：每只實(shí)驗(yàn)兔在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，拔除PICC留置管并用外科手術(shù)法分別在導(dǎo)管前、后截取兩段(靠耳緣靜脈端為前段、靠前腔靜脈端為后段)，平均每段長約5 cm；同時(shí)截取耳緣靜脈與前腔靜脈，每段長約3 cm，共4個活體標(biāo)本，分別在10%甲醛中固定，8組48只實(shí)驗(yàn)兔共計(jì)192個標(biāo)本。

1.3.5靜脈炎與血栓評價(jià)方法：目測觀察8組靜脈炎發(fā)生情況。根據(jù)聞曲等[4]報(bào)道，按照美國靜脈輸液護(hù)士學(xué)會2011年修訂標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，去除評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)疼痛的指標(biāo)，將靜脈炎分為5個等級：0級，沒有癥狀；Ⅰ級：穿刺部位出現(xiàn)紅斑，伴隨或不伴隨疼痛；Ⅱ級：穿刺部位出現(xiàn)紅斑及疼痛，和/或水腫；Ⅲ級：穿刺部位出現(xiàn)紅斑及疼痛，形成條狀痕或紋，可觸及靜脈索；Ⅳ級：穿刺部位出現(xiàn)紅斑及疼痛，形成條狀痕或紋，可觸及的靜脈索>2.5 cm。光鏡下觀察其病理變化程度，從7個方面判定：①血管腫脹，血管周圍水腫；②炎性細(xì)胞浸潤；③管壁增厚；④管腔充血；⑤纖維增生,內(nèi)皮細(xì)胞增生；⑥血管周圍出血；⑦血栓形成。

1.3.6凝血指標(biāo)與免疫指標(biāo)監(jiān)測方法：8組于置管后對應(yīng)時(shí)間分別采集實(shí)驗(yàn)兔PICC管內(nèi)靜脈血，檢測凝血酶原時(shí)間(PT)和血小板計(jì)數(shù)(PLT)，并采用ELISA法檢測C反應(yīng)蛋白(CRP)、D-二聚體(D-dimer)、E-選擇素(E-Selectin)、P-選擇素(P-Selectin)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)等含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PICC化療的靜脈炎與靜脈血栓發(fā)生率對比

觀察各組12個靜脈標(biāo)本以12個PICC導(dǎo)管標(biāo)本，目測靜脈炎發(fā)生率為33.3%共8組，n=6，均為Ⅰ級靜脈炎，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，雖無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但明顯可見第7天炎癥達(dá)高峰。光鏡觀察靜脈血栓及導(dǎo)管血栓發(fā)生率分別為9.38%和31.25%，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但第21天靜脈血栓與導(dǎo)管血栓均未發(fā)生(表1)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔PICC化療靜脈炎與靜脈血栓發(fā)生率比較

2.2 PICC化療的靜脈血管蘇木素-伊紅(HE)染色檢測結(jié)果

PICC置管第1天(對照)耳緣靜脈血管內(nèi)膜不規(guī)則破潰和纖維性增生，形成瘢痕，管腔幾乎閉塞，并伴少量出血。前腔靜脈血管內(nèi)膜不規(guī)則破潰，管壁增厚，并伴較多炎性細(xì)胞浸潤。實(shí)驗(yàn)組：第2天(首次給藥)耳緣靜脈血管壁輕微破潰，并有少量血栓。前腔靜脈血管內(nèi)膜不規(guī)則破潰、管壁增厚，并伴少量炎性細(xì)胞浸潤；第3天耳緣靜脈血管內(nèi)膜不規(guī)則破潰、內(nèi)膜纖維性增生并無血栓。前腔靜脈血管內(nèi)膜變化同第2天；第7天耳緣靜脈血管腔內(nèi)形成瘢痕，管腔未完全閉塞。前腔靜脈血管內(nèi)膜較完整，管壁略增厚，并伴少量炎性細(xì)胞浸潤；第14天耳緣靜脈血管壁輕微破潰，少量血栓，管腔較通暢。前腔靜脈血管內(nèi)膜較完整，管壁正常，并伴少量炎性細(xì)胞浸潤；第21天耳緣靜脈血管較完整，無明顯瘢痕，無血栓形成，管腔通暢。前腔靜脈血管內(nèi)膜較完整，管壁略增厚，并伴少量炎性細(xì)胞浸潤；第23天(再次給藥)耳緣靜脈血管腔內(nèi)形成瘢痕，管腔未完全閉塞。前腔靜脈血管內(nèi)膜較完整，管壁略增厚，并伴較多炎性細(xì)胞浸潤；第24天耳緣靜脈管腔內(nèi)無明顯瘢痕及血栓形成。前腔靜脈內(nèi)膜較完整，管壁正常，并伴少量炎性細(xì)胞浸潤(圖1～圖2)。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)兔PICC化療的耳緣靜脈HE染色檢測結(jié)果

圖2 各組實(shí)驗(yàn)兔PICC化療的前腔靜脈HE染色檢測結(jié)果

2.3 PICC化療的導(dǎo)管HE染色檢測結(jié)果

PICC置管第1天(對照)、第2天(首次給藥)及第23天(再次給藥)導(dǎo)管內(nèi)均有血栓，并充滿管腔。第3天導(dǎo)管內(nèi)有血栓，占部分管腔。第7、14、21及24天導(dǎo)管內(nèi)均無血栓(圖3)。

圖3 各組實(shí)驗(yàn)兔PICC化療的導(dǎo)管HE染色檢測結(jié)果

2.4 PICC化療的凝血指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果

7組實(shí)驗(yàn)兔PICC化療血清中的PLT、PT及D-dimer含量各組間比較，以及與對照組比較，差異極顯著(P<0.001，圖4)。

圖4 各組實(shí)驗(yàn)兔PICC化療的凝血指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果比較

2.5 PICC化療的免疫指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)兔PICC化療血清中，CRP、E-Selectin、P-Selectin、IL-2及IL-6含量各組間比較，并與對照組比較，差異極顯著(P<0.001，圖5)。

圖5 各組實(shí)驗(yàn)兔PICC化療的免疫指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)PICC置管引起的靜脈炎發(fā)生率為33.3%，靜脈血栓發(fā)生率為9.38%，與李俊英[5]和王紅等[6]分別報(bào)道的17%～32.3%(靜脈炎)以及26.67%(靜脈血栓)有差異。推測本研究靜脈炎較高發(fā)生率可能與以下因素有關(guān)：(1)穿刺PICC置管過程中導(dǎo)管尖端錯位或血管損傷，引起血管內(nèi)膜受損；(2)留置導(dǎo)管致局部血流緩慢；(3)導(dǎo)管屬機(jī)體異物,較快就被血漿蛋白與纖維蛋白包圍，血小板聚集；(4)給藥后引起血管內(nèi)膜損傷等。炎癥反應(yīng)在留置PICC管后1 d便出現(xiàn)，第3天(給藥后1 d)炎癥加重，第7天炎癥達(dá)高峰，第14天仍有小幅升高，直到第21天降至正常水平。這種靜脈炎癥高峰期后移以及炎癥消退時(shí)間延后的現(xiàn)象，與王紅等[7]報(bào)道的24 h出現(xiàn)靜脈炎癥反應(yīng)，48 h最顯著，約于1周恢復(fù)的時(shí)間有差異。推測產(chǎn)生以上差異的原因，除了PICC置管所致的物理性損傷外，主要與長春瑞濱刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板或嗜酸性粒細(xì)胞，致組織因子釋放，靜脈血管損傷有關(guān)，還與靜脈血栓形成有關(guān)，如圖1所示，第2天靜脈管腔已出現(xiàn)血栓，第7天血栓基本已波及整個血管壁，直至第21天血管壁內(nèi)膜完整、管腔光滑及血管損傷基本修復(fù)。可見一個化療周期的兩個療程間歇時(shí)間安排較為合理。

本研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管血栓的發(fā)生率為31.25%，明顯高于靜脈血栓的發(fā)生率，分析原因可能與導(dǎo)管內(nèi)徑較小，血流量較小及血流速度較慢有關(guān)。兩次用藥后，實(shí)驗(yàn)兔血液內(nèi)PLT明顯下降、PT縮短及D-dimer時(shí)間明顯延長，提示PICC置管及使用化療藥物后，家兔處于高凝狀態(tài)。Maemura等[8]和羅丹鳳等[9]研究表明，因長春瑞濱屬長春花堿類衍生物，該藥對微管蛋白具有較高的親和力，故能起到阻止微管蛋白聚合及誘發(fā)微管解聚等作用，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制、分裂及增殖的目的，該藥骨髓抑制程度較重，血小板減少明顯[10]。Haas等[11]證實(shí)，該藥致血管內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮細(xì)胞表面凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM)及內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)表達(dá)降低，蛋白C的活化受損，抗原提呈細(xì)胞(APC)活性減低，引起內(nèi)皮細(xì)胞(VEG)促凝及抗凝活性的平衡失調(diào)；也可引起血漿蛋白C和游離蛋白S水平下降，增加纖溶酶原激活物抑制劑PAI1水平，從而產(chǎn)生高凝狀態(tài)。同時(shí)，PICC置管產(chǎn)生的機(jī)械性刺激，加重?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加組織因子的產(chǎn)生，促進(jìn)凝血功能。周平等[12]研究提示，靜脈血栓高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為D-dimer時(shí)間延長，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符。D-dimer時(shí)間延長，可能與置管穿刺操作及化療藥物對血管造成刺激和損傷有關(guān)，經(jīng)同時(shí)激活纖溶系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)兔在PICC置管第2天、第3天以及第23天家兔的D-dimer時(shí)間延長明顯。

宋云霄等[13]發(fā)現(xiàn)，CRP與IL-6在使用化療藥物后第2天和第23天升高明顯，停藥5 d后降至較低水平。CRP主要用于感染性疾病的診斷，可反映機(jī)體的免疫功能和炎癥水平，可與IL-6相互作用，引起炎性細(xì)胞浸潤。IL-6屬于具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的一種前炎性細(xì)胞因子[14-15]，如升高說明機(jī)體處于炎癥反應(yīng)期。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)兔兩次給藥后，CRP與IL-6明顯升高，提示化療藥物對血管內(nèi)膜的刺激，導(dǎo)致靜脈炎的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)還分別測定了PICC置管后各時(shí)間點(diǎn)的E-Selectin和P-Selectin含量，E-Selectin在用藥后升高，但隨之小幅下降；P-Selectin含量在置管第3天達(dá)峰值。Krause等[16]和Silva等[17]報(bào)道，E-Selectin和P-Selectin作為一類重要的細(xì)胞黏附分子，在微血管和骨組織中恒定表達(dá)，當(dāng)機(jī)體遭遇炎癥損傷或腫瘤侵犯時(shí)，體內(nèi)的E-Selectin和P-Selectin表達(dá)便會上調(diào)，介導(dǎo)層流條件下的白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動及黏附。因此，本實(shí)驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)兔PICC置管早期，二者可能介導(dǎo)了炎癥細(xì)胞遷移、黏附，參與了靜脈損傷后修復(fù)的病理過程。其中，P-Selectin在血栓形成過程中起始動作用，使血小板與中性粒細(xì)胞黏附、聚集并形成血栓，上調(diào)單核細(xì)胞表達(dá)組織因子，進(jìn)一步引起止血異常，導(dǎo)致單核細(xì)胞在損傷的血管內(nèi)皮滾動與聚集，激活炎癥細(xì)胞引起局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮功能。

IL-2主要由經(jīng)充分活化的TH1細(xì)胞產(chǎn)生，屬人體內(nèi)一種非常重要的免疫調(diào)節(jié)因子，不僅可對T細(xì)胞分泌淋巴因子過程產(chǎn)生刺激和活化作用，參與到免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中，且還可使T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及單核細(xì)胞的細(xì)胞毒活性得到顯著性提升[18-20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-2在使用化療藥物后，呈下降趨勢，在第21天達(dá)峰值，說明實(shí)驗(yàn)兔使用長春瑞濱后，抑制TH1細(xì)胞分泌IL-2，致機(jī)體免疫力下降，經(jīng)化療間歇期的調(diào)整后，基本恢復(fù)正常。

綜上，本研究在通過建立PICC化療藥物動物模型,檢測不同時(shí)間點(diǎn)血液內(nèi)凝血指標(biāo)與免疫指標(biāo)的含量及變化規(guī)律，探討炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制及病理變化，有助于理解各指標(biāo)在血管損傷修復(fù)過程中的作用，為今后采用各指標(biāo)特性進(jìn)行PICC化療靜脈并發(fā)癥的防護(hù)研究提供依據(jù)與思路。