田永路 李 娜 田 禎 曾申明 朱德生

(1. 北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100871)(2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

外界環(huán)境中有多種因素可以導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，如營(yíng)養(yǎng)、管理等，但是溫度的變化是最主要的因素[1]。熱應(yīng)激是指處于高環(huán)境溫度中的動(dòng)物機(jī)體對(duì)于熱環(huán)境對(duì)機(jī)體提出的任何要求所做的非特異性的生理反應(yīng)的總和[2]。在熱應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中，不同的動(dòng)物組織器官或細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)熱應(yīng)激反應(yīng)具有差異性，一些組織細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激產(chǎn)生耐受性，而不耐受的組織細(xì)胞由于熱應(yīng)激的刺激出現(xiàn)損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。目前研究熱應(yīng)激影響家畜繁殖性能的較多，如Lee報(bào)道[4]，熱應(yīng)激可以使母牛的受胎率降低，而Wilson[5]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激會(huì)抑制小母牛排卵前卵泡的發(fā)育。然而，至今熱應(yīng)激對(duì)各個(gè)臟器的影響程度及臟器系數(shù)少有報(bào)道。

本研究從熱應(yīng)激對(duì)不同臟器的影響角度出發(fā)，通過(guò)對(duì)臟器系數(shù)計(jì)算比較，判斷熱應(yīng)激對(duì)臟器影響的先后順序，從而為今后抗熱應(yīng)激藥物的研發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)支持和有力動(dòng)物實(shí)驗(yàn)范式。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物選擇與分組

4周齡的SPF級(jí)ICR小鼠92只，雌性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-(京)2021-0006。小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境內(nèi)，相對(duì)濕度40%～70%，溫度22～26 ℃，在設(shè)施內(nèi)適應(yīng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(25 ℃)和熱應(yīng)激處理組(42 ℃)。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)北京大學(xué)福利審理審查，審查編號(hào)：LAC-zhuDS-1。

1.2 儀器

生化培養(yǎng)箱、CO2檢測(cè)儀、電子體溫計(jì)、離心機(jī)、眼科剪、眼科鑷子和電子天平JM6102(Max=610 g，d=0.01 g)購(gòu)自余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司，用于稱動(dòng)物體質(zhì)量；電子天平BS 223S(Max=220 g，d=0.001 g)和電子天平BS 124S(Max=120 g，d=0.1 mg)購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，分別用于稱量心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及子宮和卵巢的質(zhì)量。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取92只SPF級(jí)4周齡ICR雌性小鼠，隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組和熱應(yīng)激組。對(duì)照組26只小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi)，室內(nèi)溫度25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%；熱應(yīng)激組66只小鼠，每天分兩批放入42 ℃(實(shí)測(cè)溫度在41～43 ℃)的生化培養(yǎng)箱中熱應(yīng)激3 h，熱應(yīng)激期間小鼠自由采食和飲水，熱應(yīng)激結(jié)束后將小鼠放回屏障環(huán)境飼養(yǎng)，重復(fù)4周，期間每周隨機(jī)取對(duì)照組和熱應(yīng)激組小鼠進(jìn)行樣本收集，取樣情況見(jiàn)表1。電子天平稱量安靜狀態(tài)下小鼠體質(zhì)量，并記錄；采用1.25%的三溴乙醇過(guò)量麻醉對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，然后解剖采取小鼠卵巢、子宮、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟并進(jìn)行稱質(zhì)量。

表1 實(shí)驗(yàn)方案

臟器的獲取與稱質(zhì)量：取一平板泡沫放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，先用75%乙醇進(jìn)行消毒。對(duì)所使用的手術(shù)器械進(jìn)行消毒處理。將處死后的小鼠置于泡沫板上，用大頭針固定好小鼠的四肢，小鼠腹部朝上，用75%乙醇對(duì)小鼠腹部消毒。剪開(kāi)腹部，依次摘取卵巢、子宮、脾臟、肝臟、腎臟、心臟和肺臟，剔除表面脂肪、筋膜及吸凈表面血跡后稱質(zhì)量。為了避免人為因素造成的測(cè)量誤差，采取固定人員、固定儀器和固定測(cè)量方法的措施[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 熱應(yīng)激對(duì)雌性小鼠體質(zhì)量的影響

在進(jìn)行熱應(yīng)激處理后，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、貪睡、腹部和頸部多汗等現(xiàn)象。與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的熱應(yīng)激處理，小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降(P<0.01)，如表2所示。熱應(yīng)激3 h/d，在第7天、第14天、第21天和第28天時(shí)分別記錄小鼠體質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激組的小鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，體質(zhì)量下降均值分別為4.06 g、5.93 g、4.51 g和7.13 g。

表2 熱應(yīng)激對(duì)雌性小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 熱應(yīng)激對(duì)雌性小鼠生殖臟器系數(shù)的影響

熱應(yīng)激3 h/d，在處理7 d、14 d、21 d和28 d后，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激組小鼠的子宮系數(shù)均不存在顯著性差異(P>0.05)，而卵巢系數(shù)在處理后的第28天顯著高于對(duì)照組小鼠(P<0.05)。對(duì)子宮和卵巢兩個(gè)生殖臟器系數(shù)觀察，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激組小鼠的百分比，在第7天、第14 天、第21天和第28天時(shí)，略高于對(duì)照組(表3)。

表3 熱應(yīng)激對(duì)雌性小鼠生殖臟器系數(shù)的影響

2.3 熱應(yīng)激對(duì)雌性小鼠實(shí)質(zhì)性臟器系數(shù)的影響

從表4中可以看出，熱應(yīng)激3 h/d，在第7天時(shí)，熱應(yīng)激組小鼠的肝臟系數(shù)極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，脾臟系數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而心臟、肺臟和腎臟系數(shù)高于對(duì)照組，但與對(duì)照組之間不存在顯著差異(P>0.05)；在第14 天時(shí)，熱應(yīng)激組小鼠的心臟系數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，肺臟系數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而其他臟器系數(shù)之間不存在顯著差異(P>0.05)；在第21天時(shí)，熱應(yīng)激組小鼠的肝臟系數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而其他臟器系數(shù)之間不存在顯著差異(P>0.05)；在第28天時(shí)，熱應(yīng)激組小鼠的心臟系數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，腎臟和肺臟系數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，肝臟系數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而脾臟系數(shù)低于對(duì)照組，但與對(duì)照組之間不存在顯著差異(P>0.05)。

表4 熱應(yīng)激對(duì)雌性小鼠實(shí)質(zhì)性臟器系數(shù)的影響

3 討論

一些研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后會(huì)導(dǎo)致豬采食量和體質(zhì)量下降以及SD大鼠熱應(yīng)激會(huì)使其攝食量明顯下降，飲水量增多[7-8]。大多數(shù)研究認(rèn)為高溫會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)加速分解代謝，使機(jī)體出現(xiàn)負(fù)氮平衡，造成體質(zhì)量下降。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠體質(zhì)量隨周齡呈遞增趨勢(shì)，而熱應(yīng)激組小鼠體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)期間基本維持在20 g左右，與對(duì)照組小鼠體質(zhì)量之間存在差異顯著，這與之前報(bào)道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理組可以造成小鼠卵巢和子宮的實(shí)際質(zhì)量下降，這與Rozenboim[9]發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激會(huì)造成蛋雞卵巢質(zhì)量下降的結(jié)果相一致，但是對(duì)于子宮和卵巢兩個(gè)生殖臟器系數(shù)的觀察，在第7天、第14天、第21天和第28天時(shí)發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激組小鼠的百分比，略高于對(duì)照組，推測(cè)原因?yàn)闊釕?yīng)激組小鼠體質(zhì)量較小，雖然卵巢和子宮的實(shí)際質(zhì)量下降，但臟器系數(shù)反而升高，說(shuō)明當(dāng)小鼠受到外界的刺激時(shí)，首先對(duì)生殖系統(tǒng)進(jìn)行保護(hù)，以保持其繁殖的能力。實(shí)質(zhì)性臟器損傷順序?yàn)樽钕仁艿接绊懙氖歉闻K和脾臟，其次是心臟和肺臟，最后影響到腎臟。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明動(dòng)物機(jī)體受到外界刺激時(shí)，優(yōu)先保護(hù)泌尿生殖系統(tǒng)，以確保后代繁衍。具體原因還需進(jìn)一步研究探討。

本研究以小鼠為研究對(duì)象，熱應(yīng)激對(duì)不同臟器影響，通過(guò)對(duì)臟器系數(shù)的比較，發(fā)現(xiàn)了熱應(yīng)激對(duì)于動(dòng)物機(jī)體臟器損傷的規(guī)律，為以后的抗熱應(yīng)激藥物的研發(fā)提供了可靠的數(shù)據(jù)支持和有力的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)范式。