張燕華 孫 超 馬 會(huì) 湯連升

(山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評(píng)價(jià)中心，濟(jì)南 250101)

生殖毒理學(xué)主要研究對(duì)雌雄生命生殖系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用的原因、機(jī)制和后果，它包括對(duì)動(dòng)物的精卵形成、交配、排卵、射精、合子形成、著床、妊娠、分娩和哺乳過程的毒理學(xué)作用，當(dāng)具有生殖毒性的外源性物質(zhì)在此期間與機(jī)體接觸，會(huì)影響動(dòng)物的生殖發(fā)育，造成損害作用。藥物非臨床生殖毒性實(shí)驗(yàn)則是研究藥物對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)及其功能活動(dòng)毒副現(xiàn)象和作用機(jī)制的具體方法和技術(shù)，其評(píng)價(jià)方法主要包括生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)(生殖Ⅰ段毒性實(shí)驗(yàn))、胚胎-胎仔發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)(生殖Ⅱ段毒性實(shí)驗(yàn))和圍產(chǎn)期毒性實(shí)驗(yàn)(生殖Ⅲ段毒性實(shí)驗(yàn))[1-2]。

1 生殖毒性實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的主要數(shù)據(jù)

生殖毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量多、過程繁瑣復(fù)雜、產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量大、指標(biāo)眾多及生殖毒性實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的主要數(shù)據(jù)從傳統(tǒng)意義上可以劃分為計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料[3-4](表1)，不同類型的數(shù)據(jù)具有不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。在做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，需要根據(jù)數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，選取合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，作出相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)判斷。

表1 實(shí)驗(yàn)類別及數(shù)據(jù)類型分類

2 生殖毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法

不同的數(shù)據(jù)分析應(yīng)選用不同的統(tǒng)計(jì)方法，應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)類型以及數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布、總體方差是否相等，進(jìn)而選用適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法[5]，表2列出了毒理實(shí)驗(yàn)中常用的幾種統(tǒng)計(jì)方法[6-8]。通過以上對(duì)生殖毒性實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納分析，得出生殖毒性產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)主要分為母體數(shù)據(jù)和胎仔數(shù)據(jù)，根據(jù)不同數(shù)據(jù)的特點(diǎn)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法。

2.1 母體計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)方法

生殖毒性實(shí)驗(yàn)一般包括對(duì)照組和受試物的高、中、低劑量組等，所以產(chǎn)生的母體計(jì)量資料屬于完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多樣本數(shù)據(jù)間的均數(shù)比較，可以選用方差分析進(jìn)行多樣本數(shù)據(jù)間的比較。由于數(shù)據(jù)的分布特征會(huì)因不同的實(shí)驗(yàn)、不同的時(shí)間測(cè)定出現(xiàn)不同的結(jié)果，所以應(yīng)首先對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，而生殖毒性實(shí)驗(yàn)中因每組動(dòng)物受孕數(shù)量的不同，使得每組樣本數(shù)不同，所以不適于采用Hartevl最大方差比檢驗(yàn)法，可以選用Bartlett檢驗(yàn)或Levene檢驗(yàn)(表2)。

表2 常用的統(tǒng)計(jì)方法及適用條件

若總體方差相等，則選用方差分析進(jìn)行總體均數(shù)間的比較，若總體均數(shù)存在顯著性差異時(shí)，需進(jìn)行兩兩比較，生殖毒性實(shí)驗(yàn)只需比較各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組是否有差異，但若用t檢驗(yàn)多重比較，可能把本無差別的兩個(gè)總體均數(shù)判為有差別，所以可選擇Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。若總體方差不等，可用變量變換的方法或非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但用變量變換的方法使得結(jié)果的解釋不如原始觀測(cè)尺度方便，所以方差不齊時(shí)，一般選擇Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)方法，當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果存在顯著性差異時(shí)，應(yīng)選擇非參數(shù)Dunnett-t檢驗(yàn)法或Nemenyi法進(jìn)行兩兩多重比較[7]。

2.2 母體計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)分析方法

生殖毒性實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的如生育率、受孕率、死亡率、早產(chǎn)率和流產(chǎn)率等屬于計(jì)數(shù)資料。這些數(shù)據(jù)因沒有等級(jí)要求且實(shí)驗(yàn)組只與對(duì)照組進(jìn)行比較，所以可根據(jù)總樣本數(shù)量或理論頻數(shù)選用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[6]。

2.3 胎仔數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法

2.3.1胎仔數(shù)據(jù)的特點(diǎn)：為了探索胎仔數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，選擇生殖毒性Ⅱ段實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組胎仔畸形的部分?jǐn)?shù)據(jù)(表3)。采用SPSS中的Fisher確切概率法，以胎仔為單位對(duì)對(duì)照組(畸形數(shù)/正常胎仔數(shù)：2/67)和實(shí)驗(yàn)組(畸形數(shù)/正常胎仔數(shù)：10/60)的畸形數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到P<0.05，表明與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的畸形發(fā)生率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異；但是以窩為單位，以SPSS中非參數(shù)秩和檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的畸形率得到P>0.05，表明實(shí)驗(yàn)組的畸形率與對(duì)照組相比，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異。

表3 胎仔數(shù)據(jù)實(shí)例1

以窩為單位和以胎仔為單位得出不一樣的結(jié)論，原因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組的的胎仔畸形數(shù)大部分集中于F09號(hào)孕鼠的胎仔中，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組的畸形率僅F09較高，結(jié)果說明胎仔數(shù)據(jù)中存在窩效應(yīng)，即實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中存在孕鼠-仔鼠關(guān)系，由于同窩仔鼠接受的外界環(huán)境均相同，所以來自同一窩的仔鼠其體質(zhì)量、身長和發(fā)育指標(biāo)較所有仔鼠中隨機(jī)抽取的個(gè)體更為相似，即同窩仔鼠具有相似性和聚集性，數(shù)據(jù)是非獨(dú)立的[9-10]。若以每個(gè)胎仔作為實(shí)驗(yàn)單位，這些非獨(dú)立的數(shù)據(jù)被誤認(rèn)為成獨(dú)立數(shù)據(jù)，使得統(tǒng)計(jì)分析失去參數(shù)估計(jì)的有效性，增加犯假陽性的概率，并導(dǎo)致不合理的推斷結(jié)論[8,11]，而且以胎仔為實(shí)驗(yàn)單位時(shí)，畸形率比較小，數(shù)據(jù)的分布接近二項(xiàng)分布的極限泊松分布，所以只用計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)不足以得出正確的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

針對(duì)窩效應(yīng)的問題，胡麗娜[2]和管彤等[12]提出用窩平均法來統(tǒng)計(jì)胎仔數(shù)據(jù)，即將每窩比率作平方根反正弦變換后作參數(shù)方差分析或用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。這種以母體作為分析單元來進(jìn)行組間分析的做法雖然考慮到了窩效應(yīng)的存在，但是沒有考慮到窩大小的不均一性，假設(shè)實(shí)驗(yàn)組窩內(nèi)胎仔總數(shù)和畸形數(shù)均明顯多于相應(yīng)對(duì)照組，而采用窩平均法則不能統(tǒng)計(jì)出這一差異性。如表4所示，實(shí)驗(yàn)組的畸形數(shù)量明顯多于對(duì)照組，采用Fisher確切概率法，以胎仔為單位統(tǒng)計(jì)分析對(duì)照組(畸形數(shù)/正常胎仔數(shù)：3/96)和實(shí)驗(yàn)組(畸形數(shù)/正常胎仔數(shù)：10/88)的畸形數(shù)，顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的畸形發(fā)生率有顯著性差異(P<0.05)；但由于F10號(hào)和F14號(hào)孕鼠的胎仔總數(shù)較多，導(dǎo)致每窩畸形率差異不大，若以窩平均法采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的畸形率未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。另一方面，由于母體的觀察數(shù)量較少，以母體作為分析單元，會(huì)損失大量的數(shù)據(jù)信息，不能分析胎仔個(gè)體水平的變異，增加犯假陰性的概率[13]。

表4 胎仔數(shù)據(jù)實(shí)例2

2.3.2可用于窩效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法：目前，有研究[4，14]對(duì)處理這類多層次的聚集性數(shù)據(jù)提出了相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法，如隨機(jī)效應(yīng)logistic回歸模型、廣義估計(jì)方程和多水平模型等。隨機(jī)效應(yīng)logistic回歸模型：logistic回歸是研究二分類觀察結(jié)果與一些影響因素之間關(guān)系的一種多變量分析方法，生殖毒性實(shí)驗(yàn)中的胎仔計(jì)數(shù)資料則為多變量數(shù)據(jù)。在對(duì)生殖毒性實(shí)驗(yàn)胎仔計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析時(shí)，所建立的隨機(jī)效應(yīng)logistic回歸模型是針對(duì)窩效應(yīng)的發(fā)生率不同和變異分布不同這一特點(diǎn)對(duì)logistic回歸的擴(kuò)展，是帶有隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)的logistic回歸模型，通過對(duì)兩種模型進(jìn)行擬合，假設(shè)隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)的大小，進(jìn)而判斷檢驗(yàn)資料是否存在窩效應(yīng)，然后通過參數(shù)估計(jì)和回歸系數(shù)判斷各組間的差別[15]。這種方法可以檢驗(yàn)資料是否存在窩效應(yīng)，并在窩效應(yīng)的前提下比較各組間的差別，降低犯假陽性錯(cuò)誤的概率。

廣義估計(jì)方程(generalized estimation equations，GEE)：是在廣義線性模型的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，可用于處理分析非獨(dú)立數(shù)據(jù)，在生殖毒性實(shí)驗(yàn)的胎仔數(shù)據(jù)中，每窩胎仔之間存在組內(nèi)相關(guān)性，可以通過等相關(guān)矩陣建立GEE-logistic回歸模型[16]。多水平模型可以用來處理具有層次結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，生殖毒性實(shí)驗(yàn)中胎仔數(shù)據(jù)有母體和胎仔兩個(gè)水平單位，對(duì)于這些非正態(tài)數(shù)據(jù)，可以建立兩水平logistic回歸模型，通過預(yù)測(cè)性擬似然法和二階近似法對(duì)模型進(jìn)行估計(jì)，再通過Wald檢驗(yàn)得出比較結(jié)果[16-17]。這兩種模型中兩水平logistic回歸模型可以方便的分解開兩水平上的殘差，便于考慮窩效應(yīng)的具體影響。

這幾種統(tǒng)計(jì)方法雖然可以準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)存在窩效應(yīng)的數(shù)據(jù)，但是這些方法過程復(fù)雜，需要借助像SAS、SPSS、SUDAAN等專業(yè)的統(tǒng)計(jì)軟件來處理[13-17]。為此，需要將百分率統(tǒng)計(jì)法和頻數(shù)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)相結(jié)合的方法來處理胎仔計(jì)數(shù)資料。首先計(jì)算每只母體的胎仔畸形率，將其合并到劑量組，因百分率數(shù)據(jù)的分布不服從正態(tài)分布，可采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)方法，如果只有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，則直接用兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；當(dāng)實(shí)驗(yàn)組數(shù)大于等于三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的時(shí)候，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。頻數(shù)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)法：即分別以窩為單位和以每個(gè)胎仔為單位匯總窩畸形頻數(shù)和胎仔畸形頻數(shù)后，將其處理為四格表資料，直接用Fisher確切概率法進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)。本文以表4數(shù)據(jù)為例，簡要介紹了其在SPSS19.0中的操作過程(表5)。這種方法在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，需要綜合考慮兩種方法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)結(jié)果的解釋沒有以上幾種方法直觀，但是這種方法在統(tǒng)計(jì)軟件中操作方便，簡單易懂，在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，可以根據(jù)自身情況選擇合適的方法。

表5 SPSS操作過程

2.4 胎仔計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)方法

胎仔數(shù)據(jù)中還有像體質(zhì)量、身長、胎盤質(zhì)量、胎仔骨化數(shù)等一樣的計(jì)量資料，對(duì)于這些數(shù)據(jù)，可以選擇窩平均法對(duì)胎仔計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，也可以選擇前文提到的廣義估計(jì)方程和多水平模型來處理這些非獨(dú)立數(shù)據(jù)。

3 小結(jié)

藥物安全性評(píng)價(jià)的目的為通過統(tǒng)計(jì)分析安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，得出藥物的毒性相關(guān)信息。生殖毒性實(shí)驗(yàn)過程繁瑣復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)多樣，尤其是窩效應(yīng)和窩大小的不均一性越來越受到研究者們的重視，所以對(duì)于實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)需要根據(jù)數(shù)據(jù)的特點(diǎn)選用合適的統(tǒng)計(jì)分析方法。生殖毒性實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可以根據(jù)數(shù)據(jù)的特點(diǎn)將其分為母體數(shù)據(jù)和胎仔數(shù)據(jù)，其母體數(shù)據(jù)可以按照常規(guī)的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。窩效應(yīng)的存在使得生殖毒性實(shí)驗(yàn)中胎仔數(shù)據(jù)成為非獨(dú)立數(shù)據(jù)，可以選用本文提到的隨機(jī)效應(yīng)logistic回歸模型、廣義估計(jì)方程和多水平模型等或者百分率統(tǒng)計(jì)和頻數(shù)統(tǒng)計(jì)相結(jié)合的方法對(duì)胎仔數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并根據(jù)胎仔畸形的類型以及背景數(shù)據(jù)做出合理的判斷。