朱曉燕 劉 勤, 白惠玲 金 濤 張 書 張延英 康萬(wàn)榮

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000)(2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，蘭州 730000)(3.甘肅省人民醫(yī)院眼科，蘭州 730000)

2型糖尿病(rype 2 diabetes mellitus，T2DM)是臨床最常見的慢性病及基礎(chǔ)疾病之一。近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，T2DM的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是T2DM患者中較常見的一種微血管并發(fā)癥，亦是導(dǎo)致盲眼病的重要原因[2]。根據(jù)Olivares等[3]報(bào)道，國(guó)內(nèi)對(duì)DR的研究多集中在1型DR模型上，理想的2型DR動(dòng)物模型仍處發(fā)展階段，國(guó)外建立2型DR動(dòng)物模型多采用基因敲除法。由于條件所限，國(guó)內(nèi)用這種方法建立模型尚有困難，且因無(wú)法在活體上動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)視網(wǎng)膜變化，國(guó)內(nèi)以往對(duì)于DR大鼠視網(wǎng)膜的觀察多在離體眼球上進(jìn)行，導(dǎo)致動(dòng)物所需數(shù)量較多。因此，研究較為簡(jiǎn)單的方法建立理想的2型DR模型并優(yōu)化觀察視網(wǎng)膜的方法具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用SD大鼠建立2型DR模型，并通過(guò)眼底熒光造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)和病理形態(tài)改變動(dòng)態(tài)的觀察視網(wǎng)膜，以了解大鼠眼底血管形態(tài)及病變嚴(yán)重程度，以期為DR相關(guān)治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠80只，雄性，6周齡，體質(zhì)量(150±20)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(甘)2020-0009，所有大鼠屈光間質(zhì)清晰，外眼及眼前節(jié)檢查均無(wú)異常表現(xiàn)，常規(guī)飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵守甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查編號(hào)：2020-298。

1.1.2試劑與儀器：鏈脲佐菌素(strep-tozotocin，STZ)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)616S0212；檸檬酸和檸檬酸鈉，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20161101，20171010；復(fù)方托吡卡胺滴眼液購(gòu)自沈陽(yáng)興齊眼藥股份公司，批號(hào)200802；熒光素鈉注射液，購(gòu)自Alcon Research LLC，批號(hào)314040F；血糖儀及試紙，購(gòu)自拜耳(中國(guó))有限公司，批號(hào)DP9LM3F02 A；大鼠胰島素ELISA試劑盒，購(gòu)自江蘇菲亞生物科技有限公司；高脂高糖飼料，購(gòu)自沈陽(yáng)茂華生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2017-0001，基礎(chǔ)飼料上加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇及1%膽酸鈉；眼球固定液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；眼底血管熒光造影機(jī)(型號(hào)SpectralisHRA+Multicolor)購(gòu)自德國(guó)海德堡公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠分組及造模：將所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組及T2DM組，n=40。造模方法根據(jù)王保偉等[4]研究，將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空白對(duì)照組給予普通飼料，T2DM組給予高脂高糖飼料，喂養(yǎng)4周，禁食不禁水16 h后，T2DM組按30 mg/kg腹腔注射STZ(STZ溶于0.1 mol/L的pH 4.5的檸檬酸鈉緩沖液中，配成1%溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，30 min內(nèi)用完)以誘發(fā)T2DM；空白對(duì)照組僅注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，在大鼠尾靜脈采血，用血糖儀檢測(cè)血糖濃度，凡空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L、HOMA-IR增加伴尿量及飲水量均明顯增多的大鼠作為T2DM成模標(biāo)準(zhǔn)。模型成立后，將T2DM組40只大鼠隨機(jī)分為造模后3個(gè)月組、造模后4個(gè)月組、造模后5個(gè)月組及造模后6個(gè)月組，每組10只。

1.2.2模型的觀察指標(biāo):注射STZ后，每天觀察并記錄大鼠的一般狀況，主要包括精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、運(yùn)動(dòng)情況、攝食量、飲水量、墊料潮濕程度等，并及時(shí)更換尿濕的墊料；每周測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量、隨機(jī)血糖、空腹血糖及空腹血清胰島素(FINS)指標(biāo)，比較各組的體質(zhì)量變化及血糖值變化并計(jì)算分析HOMA-IR(=空腹血糖×FINS/22.5)。

1.2.3FFA檢查:大鼠T2DM造模后3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月及6個(gè)月進(jìn)行FFA檢查。所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg進(jìn)行麻醉，雙眼滴復(fù)方托吡卡胺散瞳，將大鼠麻醉、散瞳后移至熒光造影機(jī)前，按0.5 mL/kg向腹腔注射10%熒光素鈉，注射后即開始攝影，主要以視盤為正中心拍攝中心圖。另外，根據(jù)實(shí)際情況可拍攝上、下、左、右的視網(wǎng)膜情況。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色:分別于T2DM造模后3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月及6個(gè)月FFA檢查完畢后頸椎脫臼處死大鼠，迅速摘除眼球，眼球固定液固定，石蠟包埋后切片，切片時(shí)定位到靠近視神經(jīng)完整的視網(wǎng)膜進(jìn)行縱切，使切片之間具可比性，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)柔順光滑，活潑好動(dòng)，每日攝食量和飲水量適中，墊料干燥；T2DM組大鼠STZ腹腔注射后第1周，大鼠表現(xiàn)出多食、多飲、多尿及體質(zhì)量減輕的糖尿病癥狀，隨著病程延長(zhǎng)，大鼠逐漸表現(xiàn)出精神萎靡，毛發(fā)雜亂枯黃、易脫毛，倦怠懶動(dòng)，每日的飲食、飲水及尿量明顯增多，墊料潮濕并伴爛蘋果味。隨時(shí)間增加，上述癥狀愈加明顯，伴體型極度消瘦萎靡、皮包骨樣、弓背蜷縮且狀態(tài)不佳。

2.2 體質(zhì)量及血糖變化

造模前，空白對(duì)照組與T2DM組大鼠體質(zhì)量和血糖差異無(wú)顯著性(P>0.05)；造模后，空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增加，T2DM組大鼠體質(zhì)量增加不明顯且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)伴有不同程度的減輕。T2DM造模后3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月及6個(gè)月時(shí)大鼠體質(zhì)量明顯減輕，與空白對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；血糖顯著升高，與空白對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，見圖1和圖2所示。

圖1 不同病程各組大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)

圖2 不同病程各組大鼠血糖變化趨勢(shì)

2.3 HOMA-IR比較

造模前，空白對(duì)照組和T2DM組大鼠FINS和HOMA-IR差異無(wú)顯著性(P>0.05)；造模后，T2DM組FINS和HOMA-IR較空白對(duì)照組顯著升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后差異極顯著(P<0.01)。造模后，F(xiàn)INS和HOMA-IR之所以升高，考慮原因是高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射只是部分破壞了大鼠胰島B細(xì)胞功能，說(shuō)明此種造模方法已經(jīng)成功復(fù)制出了大鼠胰島素抵抗模型，即T2DM模型(表1)。

表1 造模前后兩組大鼠FINS和HOMA-IR比較

2.4 FFA檢查情況

空白對(duì)照組大鼠眼底清晰且視網(wǎng)膜血管走行規(guī)則、粗細(xì)均勻一致并以視盤為中心呈放射狀分布；T2DM組：3個(gè)月大鼠眼底尚清晰、視網(wǎng)膜血管走行迂曲、可見微動(dòng)脈瘤及少量點(diǎn)狀強(qiáng)熒光；4個(gè)月大鼠視網(wǎng)膜血管不規(guī)則擴(kuò)張、并可見毛細(xì)血管叢及大面積強(qiáng)熒光滲漏；5個(gè)月大鼠眼底模糊、血管周圍可見熒光滲漏及片狀出血；6個(gè)月大鼠因晶體混濁眼底窺不清、隱見血管走行迂曲且血管周圍可見熒光滲漏及出血(圖3)。

圖3 不同病程各組大鼠FFA結(jié)果

2.5 HE染色

空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整且排列整齊、細(xì)胞形態(tài)正常、內(nèi)界膜清晰可見，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞單層排列，內(nèi)核層由3～5層細(xì)胞構(gòu)成，外核層較厚，由8～10層細(xì)胞排列而成；T2DM組3個(gè)月大鼠，各層細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見擴(kuò)張的血管(×200)，內(nèi)外核層細(xì)胞數(shù)量減少，排列稀疏；T2DM組4個(gè)月大鼠，各層細(xì)胞排列紊亂且界限不清，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見血管樣結(jié)構(gòu)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)、外核層水腫；T2DM組5個(gè)月大鼠，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水腫，可見突破內(nèi)外叢狀層的血管樣結(jié)構(gòu)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，內(nèi)外核層界限不清、細(xì)胞稀疏、排列紊亂、出現(xiàn)空泡樣變和異常血管樣結(jié)構(gòu)；T2DM組6個(gè)月大鼠，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)一步減少，內(nèi)外核層間界限消失，結(jié)構(gòu)紊亂甚至中斷，細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)外核層空泡樣變性明顯，可見大量穿行于內(nèi)外核層的迂曲血管，見圖4所示。

圖4 不同病程各組大鼠視網(wǎng)膜HE

3 討論

DR作為T2DM嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致視力永久性喪失[5]，而該病的患病率也在逐年增加，據(jù)估計(jì)到2040年全球約有6.24億人患有糖尿病[6]，其中T2DM占糖尿病總數(shù)的90%～95%[7]。臨床研究表明，DR的發(fā)病與T2DM的病程和血糖水平直接相關(guān)[8]，因此建立理想的T2DM動(dòng)物模型是研究DR的重要基礎(chǔ)。

根據(jù)林春華等[9]，T2DM動(dòng)物模型按造模方式主要分為三類：自發(fā)性T2DM動(dòng)物模型、誘導(dǎo)性T2DM動(dòng)物模型和轉(zhuǎn)基因T2DM動(dòng)物模型，但是自發(fā)性和轉(zhuǎn)基因T2DM動(dòng)物因價(jià)格昂貴、來(lái)源相對(duì)較少等缺點(diǎn)，限制其在科學(xué)研究方面的應(yīng)用和普及，而實(shí)驗(yàn)性T2DM動(dòng)物模型則因?yàn)槌杀据^低、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最為廣泛。建立T2DM動(dòng)物模型常用的實(shí)驗(yàn)方法包括手術(shù)誘導(dǎo)、飲食誘導(dǎo)、藥物誘導(dǎo)、聯(lián)合誘導(dǎo)等，其中因聯(lián)合誘導(dǎo)(高脂高糖飲食聯(lián)合小劑量STZ)的T2DM大鼠能較好的模擬T2DM的發(fā)病因素、病理過(guò)程和臨床特征，并且造模時(shí)間相對(duì)較短，成本相對(duì)較低，而成為該病的理想造模方法[10-11]。高脂高糖飲食可通過(guò)降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰島素敏感性，使機(jī)體糖耐量降低從而誘發(fā)胰島素抵抗[12]。STZ是一種廣譜抗菌素，對(duì)動(dòng)物胰島B細(xì)胞具有特異性的毒性作用，它會(huì)選擇性損傷胰島B細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌減少[13]，而胰島素抵抗和胰島功能受損是T2DM的典型病理生理特征和重要依據(jù)[14]。Gheibi等[15]以高脂喂養(yǎng)大鼠2周后，單次腹腔注射STZ 30 mg/kg 建立T2DM模型；Gomaa等[16]以高脂喂養(yǎng)大鼠4周后單次腹腔注射STZ 25 mg/kg建立T2DM模型。因此，結(jié)合上述文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周聯(lián)合小劑量STZ 30 mg/kg腹腔注射建立T2DM大鼠模型，大鼠模型血糖維持較好，且在長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)無(wú)一死亡。

雖然有大量的物種被用于制作DR模型，比如小鼠、大鼠、貓、狗、豬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，但大鼠模型仍是最常被研究的，因?yàn)樗鼈凅w積適中、壽命短且繁殖速度快，可以進(jìn)行最有效的研究[17]。目前，國(guó)內(nèi)DR模型常用的大鼠品系是SD大鼠或者Wistar大鼠。章成昌等[18]選用Wistar大鼠，因?yàn)閃istar大鼠不僅有SD大鼠的優(yōu)良基因，且比SD大鼠更溫順，有利于實(shí)驗(yàn)操作的進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集，但是農(nóng)慧等[19]用相同劑量的STZ造模，發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠的死亡率可以達(dá)到50%以上，可見SD大鼠的抵抗力強(qiáng)于Wistar大鼠。由于本實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，對(duì)大鼠的生存能力要求較高，故選用SD大鼠。

莊秋霞等[20]和姜曉丹等[21]研究表明，F(xiàn)FA是臨床上診斷DR時(shí)最常采用的一種方法，它可以通過(guò)動(dòng)態(tài)反映視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的實(shí)時(shí)循環(huán)情況從而實(shí)現(xiàn)DR的早期診斷和分期，即使是微小病變也能準(zhǔn)確捕捉，而目前DR大鼠模型驗(yàn)證方面恰恰缺乏這部分內(nèi)容。以往國(guó)內(nèi)針對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜的觀察主要在離體眼球上進(jìn)行[22-24]，但這些方法較為局限，因?yàn)闊o(wú)法在活體上動(dòng)態(tài)觀察眼底改變，它意味著必須先處死大鼠才能觀察到視網(wǎng)膜，因此大鼠使用量較大，不符合3R操作原則。鑒于此，本研究結(jié)合FFA和HE染色，在活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T2DM大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)病變的基礎(chǔ)上，再處死大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變的觀察，研究方法的改進(jìn)在符合動(dòng)物倫理學(xué)要求的原則下更加全面的模擬T2DM的DR大鼠模型。由于條件所限，本研究對(duì)大鼠行FFA檢查時(shí)，使用為人眼設(shè)計(jì)的海德堡血管造影機(jī)，但人眼球的參數(shù)與大鼠眼球參數(shù)存在明顯區(qū)別，這種差異導(dǎo)致需要耗費(fèi)大量時(shí)間調(diào)整動(dòng)物眼位才能獲得FFA圖像。若能改進(jìn)技術(shù)，可以調(diào)整適應(yīng)大鼠的眼球參數(shù)，便能更加簡(jiǎn)便地獲得DR大鼠FFA圖片。同時(shí)在研究過(guò)程中，隨著T2DM大鼠病程的延長(zhǎng)，尤其至6個(gè)月時(shí)，大鼠普遍發(fā)生白內(nèi)障，嚴(yán)重的晶狀體混濁導(dǎo)致FFA不能評(píng)估視網(wǎng)膜血管的變化并無(wú)法獲得清晰的FFA圖片。如果研究初期，能同時(shí)結(jié)合光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)、FFA和HE技術(shù)，不僅能對(duì)補(bǔ)后期難以進(jìn)行的FFA問(wèn)題，還有助于活體上觀察T2DM大鼠視網(wǎng)膜厚度的動(dòng)態(tài)變化，從而可以進(jìn)一步與HE結(jié)果對(duì)比分析，這無(wú)疑對(duì)研究DR模型具有更重要的意義。

總之，本研究通過(guò)高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周聯(lián)合30 mg/kg STZ腹腔注射建立的T2DM大鼠模型，并應(yīng)用FFA和病理學(xué)技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)到T2DM大鼠在病程3個(gè)月時(shí)觀察到視網(wǎng)膜血管發(fā)生的病變，同時(shí)也觀察到DR的病理形態(tài)學(xué)改變。隨著病程延長(zhǎng)，病變也在逐漸加重。因此，該模型的成功建立以及病變的驗(yàn)證方法可以被進(jìn)一步用于研究T2DM的DR發(fā)病機(jī)制及對(duì)新型抗DR藥物的評(píng)估。